乙型肝炎病毒基因組1896位點變異株與野生株的定性檢測＊

郭龍華，陳 茶，萬澤民，何文軍，吳新忠，周 強，馮春顏，吳文權

（1.深圳市龍華人民醫院檢驗科，廣東 深圳 518109；2.廣東省中醫院檢驗科，廣州 510120）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是不完全雙鏈環狀DNA病毒，HBV復制過程中要經過逆轉錄，由于逆轉錄酶缺乏有效的堿基校對功能，故HBV基因組比一般DNA病毒易發生變異［1－3］。HBV前C區定位于乙肝病毒基因組nt1814－1900，前C區是HBV基因組的高變區，前C區最常見的變異為G1896A點突變，使第28位密碼子TGG→TAG（終止子），翻譯提前終止，導致 HBeAg陰轉，影響干擾素療效［4－5］。目前一些常用方法對前C區1896位點變異株與野生株的混合感染易漏檢，本文介紹的方法能同時定性檢測前C區1896位點變異株與野生株，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標本 來源于廣東省中醫院2011年1月至2月門診和住院患者，共收集40例HBV DNA含量高于1×104IU／mL血清標本。

1.1.2 主要儀器 Roche公司LightCycler型熒光定量PCR儀、法國VL公司Bio－1D型凝膠成像儀、飛鴿牌TGL－16B臺式高速離心機。

1.1.3 主要試劑 廣州達安基因公司HBV DNA熒光定量PCR檢測試劑盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（國產），裂解液（自配）。Taq DNA 酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、DNA Marker（TaKaRa公司）。

1.1.4 引物設計與合成 參照GenBank中的HBV基因組序列，用Primer Premier 5.0軟件設計3條特異性引物：正義引物P1：5′－GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG－3′（nt 1669－1688）；反義引物P2：5′－CGG GTC AAT GTC CAT GCC CC－3′（nt 1915－1896）；反義引物 P3：5′－CGG GTC AAT GTC CAT GCC CT－3′（nt 1915－1896）（針對突變株），由上海英駿生物技術有限公司合成。設計PCR終產物247bp。

1.2 方法

1.2.1 標本選取 用廣州達安基因公司HBV DNA熒光定量PCR試劑盒檢測的HBV DNA含量高于1×104IU／mL血清標本。HBV DNA的提取方法參照文獻［6］。

1.2.2 PCR擴增 每個標本同時做2個擴增管，一管加P1、P2（5μmol／L）各1μL，另一管加P1、P3（5μmol／L）各1μL，其余所加成分相同，10×緩沖液2μL，dNTP（10mmol／L）0.4 μL，Taq DNA 酶（1U／μL）0.5μL，MgCl2（25mmol／L）0.4 μL，模板2μL，ddH2O 12.7μL，總體積20μL，95℃5min。然后94℃0.5min，58 ℃ 0.5min，72 ℃ 0.5min共循環35次，72℃延伸5min。

1.2.3 PCR產物上電泳 取PCR產物在1.2%瓊脂凝膠（含EB）上電泳，觀察結果。

1.2.4 PCR產物測序 用試劑盒分別回收和純化各一管變異株、野生株PCR產物，送上海英駿生物技術有限公司測序。

2 結 果

2.1 標本擴增結果 PCR產物電泳結果見圖1。設計產物長247bp，電泳結果與預期一致。本次實驗共檢測40個標本，有11個標本只檢測到野生株，8個標本只檢測到變異株，其余21個標本都是變異株與野生株混合感染。

圖1 PCR產物電泳結果

2.2 PCR產物測序結果

2.2.1 野生株PCR產物序列 GAC TCG CAG CAA TGT CAA CGA CCG ACC TTG AGG CAT ACT TCA AAG ACT GTT TGT TTA AGG ACT GGG AGG AGT TGG GGG AGG AGA TTA GGT TAA AGG TCT TTG TAC TGG GAG GCT GTA GGC ATA AAT TGG TCT GTT CAC CAG CAC CAT GCA ACT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG TTC ATG TCC TAC TGT TCA AGC CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG GCT TTG GGG CAT GGA CAT TGA CCC G，序列中粗體字G為野生株1896位點。

2.2.2 變異株PCR產物序列 GAC TCG CAG CAA TGT CAA CGA CCG ACC TTG AGG CAT ACT TCA AAG ACT GTT TGT TTA AGG ACT GGG AGG AGT TGG GGG AGG AGA TTA GGT TAA AGG TCT TTG TAC TGG GAG GCT GTA GGC ATA AAT TGG TCT GTT CAC CAG CAC CAT GCA ACT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CAT CTC ATG TTC ATG TCC TAC TGT TCA AGC CTC CAA GCT GTG CCT TGG GTG GCT TTA GGG CAT GGA CAT TGA CCC G，序列中粗體字A為變異株1896位點。

3 討 論

前C區是HBV基因組的高變區，前C區最常見的變異為G1896A，使第28位密碼子TGG→TAG（終止子），翻譯提前終止，導致HBeAg陰轉。一方面血液中的HBeAg可以干擾或抑制CTL對肝細胞膜上的HBcAg的攻擊，故HBeAg的減少可使CTL對肝細胞膜上的HBcAg攻擊得更為強烈，從而引起嚴重的肝損害，導致重癥肝炎。另一方面HBeAg陰轉時，影響干擾素對HBV的療效。

由于干擾素對乙型肝炎病毒患者抗病毒治療療程長、存在不良反應、患者花費大，因而治療前需對患者進行評估。HBeAg陰性患者，可用中藥方劑抗病毒治療［7］。干擾素治療對象主要是HBeAg陽性患者。在HBV感染者體內，常形成以一個優勢株為主的相關突變株病毒群，稱為準種（quasispecies）［8－9］，即變異株與野生株的混合感染。在 HBeAg陽性患者體內有些是G1896A點突變株和G1896野生株的混合感染，干擾素對G1896野生株有較好的療效，而對G1896A點突變株療效不好，對這類患者用干擾素治療體內會出現G1896A點突變株成為優勢感染株，達不到抗病毒治療的效果，因而在干擾素治療前對患者是否為G1896A點突變株和G1896野生株的混合感染進行檢測具有重要的臨床意義。如果單純是G1896野生株感染，可直接用干擾素治療。如果是G1896A點突變株和G1896野生株的混合感染，可用中藥方劑和干擾素進行中西醫結合抗病毒治療。在治療用藥中和用藥后檢測，有利于療效和預后的判斷。目前一些常用方法［10－11］對前C區1896位點變異株與野生株的混合感染易漏檢，本法能同時檢測前C區1896位點變異株與野生株混合感染，PCR產物測序也證實了本法的特異性，且簡單易行，成本較低，具有一定的應用價值。

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