2008～2009年南寧市季節性H1N1亞型流感病毒血凝素HA1基因變異分析＊

范云燕，劉海燕，林新勤，秦劍秋，黃 莉 ，覃巍巍

（廣西壯族自治區南寧市疾病預防控制中心 530023）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，流感病毒分為 A、B、C 3種型別［1］。血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）是流感病毒主要表面抗原，尤其是HA基因具有高度易變性，是流感病毒發生抗原性漂移的主要原因［2］。流感病毒的HA基因在病毒受體識別和復制中起重要作用，它不僅與機體免疫密切相關，而且還是流感病毒發生抗原性變異的分子基礎。研究表明中和抗體針對的抗原位點和受體結合位點（RBS）都位于 HA蛋白分子的頭部重鏈區（HA1）［3］。本研究通過分析2008～2009年度南寧市季節性H1N1流感病毒的流行和HA1基因的變異情況，有助于掌握流感病毒進化方向和流行動態，為及時掌握本地區流感病毒活動動態，及早預測預警流感疫情提供實驗信息和依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2008～2009年南寧市流感病毒監測哨點醫院采集到的流感樣病例咽拭子，流感疫情采集到的流感樣病例鼻咽拭子。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養 將鼻咽拭子標本接種于狗腎傳代細胞（MDCK）進行流感病毒分離培養。根據采樣時間，2008年和2009年各選取10株季節性H1N1亞型流感毒株進行序列測定分析。

1.2.2 病毒RNA的提取和HA基因全長擴增 用QIAGEN Rneasy Mini kit RNA提取試劑盒提取20份毒株RNA，方法按試劑盒說明書。取5μL RNA模板，用引物 H1N1－HA－F：5′－AGC AGG GGA AAA TAA AAM CAA CC－3′進行反轉錄，條件為：25℃10min，42℃1h，98℃5min，冰上冷卻。取5 μL cDNA為模板，分別用 H1N1－HA－F和 H1N1－HA－991R：5′－CAC TCT CCT ATT GTG ACT GGG TG－3′，以及 H1HAF768：5′－ACT ACT GGA CTC TGC TGG AAC－3′和 H1N1－HA－R：5′－TTC TGA AAT TCT GGT CTC AGA TGC－3′引物分別進行PCR，PCR條件為：95℃3min，（94℃40s，52℃40s72℃1min）35個循環，72℃10min，50μL體系，以上反轉和PCR試劑均購自Fermentas。

1.2.3 HA基因測序和分析 PCR產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行純化和測序，測序結果采用VectorNTI 9.0軟件進行分析。將獲得的HA1氨基酸序列與WHO推薦的北半球 A亞型疫苗株 A／Solomon／3／2006（2007年11月至2008年4月，ABU50586）和 A／Brisbane／59／2007（2008年11月至2010年4月，ACA28844）進行比對，并用 Mega4.1軟件構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 2008、2009年南寧市 H1N1亞型流感病毒流行情況2008、2009年南寧檢測標本分別為849份和863份，流感病毒分離培養陽性率為8.00%和26.65%，2008年以季節性H1N1（47.6%）和 H3N2（32.35%）為主，2009年以 H3N2（62.61%）為主，B型流感病毒（20.87%）其次。南寧市流感流行主要集中在夏秋季節，2008年和2009年分別在7月和9月達到病毒分離高峰。見圖1。

圖1 2008、2009年南寧市季節性流感毒株分離分布

2.2 核苷酸序列測定結果及氨基酸進化樹分析 2008～2009年20株H1N1亞型流感病毒HA全長1 698bp翻譯成566個氨基酸，HA1長為325個殘基。將20株H1N1流感病毒HA1蛋白與北半球疫苗推薦進行比對。20株H1N1聚成2個大的類群，其中A／Solomon／3／2006與2008年的毒株形成類群Ⅰ，而A／Brisbane／59／2007與2009年的毒株形成類群Ⅱ，兩疫苗株分別在類群中形成獨立的亞分支。

2.3 H1N1亞型流感病毒HA1氨基酸序列變異及蛋白質分子結構變化分析

2.3.1 HA1蛋白分子二硫鍵的變異和糖基化位點的變異情況 H1N1血凝素的基因翻譯后經過剪切，52與284、65與77、100與145、289與313的半胱氨酸C間形成二硫鍵［4］。南寧市2008～2009年20株H1N1二硫鍵形成位點未發生氨基酸水平的插入、替換或缺失。HA蛋白潛在的糖基化位點序列為N－X－T／S［5］。對糖基化位點分析發現，兩疫苗株在 HA1區有8個糖基化位點，20份本地毒株除A／nanning／621／2008氨基酸發生突變（N54K），減少一個糖基化位點。其他毒株糖基化位點相對保守，未發現氨基酸替換。

表1 2008～2009人類季節性H1N1流感病毒HA1受體結合位點變異情況位點比對

2.3.2 HA1蛋白分子上受體結合位點（RBS）的變異情況HA上的受體結合位點位于頭部末端（HA1部分），每個HA單體上有3個二級結構分別是190螺旋，130環，220環［6］。HA1編碼序列受體結合位點變異情況見表1，在3個二級結構中190的R188M（R188K）、A189T、H193N、T193K氨基酸位點均發生了整體的替換；220位環222位點在2008～2009年的毒株以及A／Brisbane／59／2007中均為氨基酸Q；另外，2009年的毒株中已有多個毒株130位環的131位點發生V131A（V131T）的替換。

2.3.3 HA1蛋白分子上抗原決定簇位點的變異情況 H1N1流感病毒HA1蛋白有4個抗原決定簇分別為Cb、Sa、Sb和Ca區［7－10］。通過對抗原位點的統計和分析，47個抗原位點有多個發生了變化，其中Sb、Ca、Cb位點相對活躍，而Sa位點相對保守。在發生氨基酸變異的抗原位點中，相對于A／Solomon／3／2006或A／Brisbane／59／2007毒株，20份毒株的 HA1發生替換的是Sb位點：185、188、189、192；Ca位點：141、167；Cb位點：73；Sa位點未發生氨基酸變異。2008年的10份毒株在188、189、193位點與兩疫苗株均不同；2009年毒株除個別毒株外，在185、189、141位點與 A／Brisbane／59／2007相比發生了整體 的 變 異，另 外 A／nanning／473／2009 和 A／nanning／662／2009分別在發生H192N、N167K點變異。

3 討 論

通過對本地檢測標本統計分析，2008～2009年南寧流感流行主要集中在夏秋季節，H1N1和H3N2交替成為2008年和2009年的優勢毒株。以上年度的H1N1血凝素基因重鏈區進化樹顯示，A／Solomon／3／2006與2008年毒株屬于分支Ⅰ，而A／Brisbane／59／2007與2009年毒株屬于分支Ⅱ。A／Brisbane／59／2007作為2008年11月至2010年4月疫苗推薦毒株，與2008年毒株相距較遠。本地毒株HA1氨基酸序列二硫鍵和糖基化位點比較保守；而HA1蛋白上的受體結合位點則相對活躍，其中190位環氨基酸位點變異最大，尤其是在188位和189位為高突變位點，但188位和189位氨基酸位點并不直接與宿主受體唾液酸發生結合，因此這些變化可能不影響RBS與受體結合的親和力［11］。Vines等［12］通過氨基酸定點替換實驗證明了流感病毒RBS第222位和224位氨基酸的變化決定了病毒感染宿主的特異性。當H3病毒的HA同時發生L222Q、S224G突變時，可使感染人的H3流感病毒能夠感染禽類。本實驗當中H1N1病毒的RBS的222和224位點分別為Q和G，這種替換是否影響病毒感染宿主的特異性，尚有待考證。流感病毒HA1蛋白上的抗原決定簇的變異情況是評價該毒株是否有流行病學意義的關鍵因素，新變種必須具備在其HA區抗原位點有4個以上氨基酸突變，而且必須分布在2抗原決定簇區［13］。分析表明，2009年毒株除 A／nanning／473／2009外，與對應的疫苗株相比抗原決定簇區氨基酸變異未達到4個；2008年毒株與A／Solomon／3／2006相比則存在4個氨基酸的替換并且分布在兩個抗原決定簇區域。因此，可以推測，2008年根據WHO疫苗推薦株生產的疫苗對該年南寧市H1N1亞型流感預防效果可能并不理想，這將導致2008年南寧市 H1N1亞型的流行的強度明顯增加。而經歷了2008年的流行后，人群中有了保護抗體，同時H1N1疫苗及時更新，使得H1N1在2009年流行強度有了明顯下降。

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