柑桔潛葉蛾性信息素組分的鑒定

陳麗萍，楊 力

（1.漳州市農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)監(jiān)測中心，福建 漳州 363000；2.漳州市英格爾農(nóng)業(yè)科技有限公司，福建 漳州 363000）

柑桔潛葉蛾又稱為“鬼畫符”、“繪圖蟲”，屬鱗翅目、桔潛葉蛾科，是華南柑桔的一種重要害蟲，主要危害：柑橘、金橘、檸檬、二月蘭、構(gòu)橘、四季橘等花木。目前防治柑桔潛葉蛾比較有效的方法還是采用藥劑防治，但長期使用化學(xué)藥劑會造成柑桔潛葉蛾抗藥性增強(qiáng)、果實(shí)農(nóng)殘、污染環(huán)境、破壞自然生態(tài)系統(tǒng)平衡等眾多問題。

信息素是生物體之間起化學(xué)通訊作用的化合物的統(tǒng)稱,是昆蟲交流的化學(xué)分子語言，包括性信息素、聚集信息素、追蹤信息素、告警信息素、疏散信息素、利它素、利己素、協(xié)同素。利用昆蟲性信息素進(jìn)行蟲情監(jiān)控與害蟲防治具有靈敏度高、安全無毒、?；詮?qiáng)、對天敵及有益生物安全、不污染環(huán)境等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

由于昆蟲信息素具有高效、無毒、沒有污染、不傷益蟲等優(yōu)點(diǎn)，國內(nèi)外對昆蟲信息素的研究與應(yīng)用都很重視。經(jīng)過幾十年的發(fā)展我國的昆蟲信息素的研究水平已經(jīng)進(jìn)入到了一個(gè)新的階段，同時(shí)腺體提取、空氣固相微量提取法(SPME)，氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用分析(GC—MS)技術(shù)，風(fēng)洞技術(shù)室內(nèi)測試，觸角電位(EAG)技術(shù)等一系列技術(shù)的應(yīng)用也為信息素的研究提供便利。本文對柑桔潛葉蛾性信息素的提取鑒定進(jìn)行了綜述。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試蟲源。柑桔潛葉蛾于2012年6月初采自漳州市長泰縣五四農(nóng)場。采集回的柑桔潛葉蛾老熟幼蟲飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲籠(10cm×10cm×10cm)中，養(yǎng)蟲籠底部鋪一層細(xì)的沙壤土。飼養(yǎng)條件：養(yǎng)蟲室光周期 L：D=12：12，光期于 6：00 開始至 18：00結(jié)束，溫度26℃，相對濕度65%～75%。安置40W的熒光燈4盞用于夜間觀察。以寄主植物柑桔樹鮮葉為飼養(yǎng)材料飼喂至幼蟲化蛹，羽化后飼喂15%的蜂蜜水和純水。成蟲羽化后0～24h被視作1日齡。

（2） 儀器和試劑主要儀器。有氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（HP6890N-HP5975B）、氣相色譜儀GC-2010（帶 FID檢測器）、自制風(fēng)洞。試劑：正己烷（色譜純）。

1.2 柑桔潛葉蛾性信息素腺體成分的提取

將處理過的單個(gè)未交配雌蛾先冷凍麻醉，然后尾端朝前翅膀反折裝入一根內(nèi)徑2.5mm，長50mm的細(xì)玻管，玻管末端有一個(gè)0.6mm的小孔。用吸球?qū)⑾x體吸到玻管末端，再用一根細(xì)棒推頂一團(tuán)松軟的小棉球?qū)οx體輕柔地施加壓力，使產(chǎn)卵器和性信息素腺體穿出小孔 (蟲體其它部分被隔離在玻管內(nèi))。當(dāng)囊狀的腺體外翻突起時(shí)，停止施加壓力，立即將玻管插入收集器的橫交管，以40ul/min的凈化氮?dú)饬鞔迪袤w表面10min，腺體釋放的性信息素被吸附于松緊適度的清潔的玻璃棉上，收集結(jié)束后小心取出的雌蛾仍是活的。然后立即在玻璃棉上滴加10mg飽和十六碳醋酸酯做內(nèi)標(biāo)，再用總量為40μL的重蒸正己烷分4次淋洗收集器內(nèi)壁和玻璃棉，這些淋洗液被收集在一個(gè)內(nèi)徑5mm、長20mm的尖底玻管中，在氮?dú)饬飨聺饪s至約5μL，注射到氣相色譜儀中進(jìn)行分析。以上收集操作在室溫25℃下進(jìn)行。

1.3 氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析

（1）GC-MS分析采用 HP6890N—HP5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀。GC-MS條件：氣譜以99.999%氦氣作為載氣，流速1mL/min，進(jìn)樣口溫度220℃，無分流進(jìn)樣，升溫程序?yàn)?50℃（2min） 2℃/min 90℃ 10℃/minl60℃ 20℃/min220℃（2min）。質(zhì)譜采用CI電離方式，掃描范圍40～300 m/z，掃描頻率5次/秒。

（2）氣相色譜分析。GC條件：進(jìn)樣口溫度230℃，檢測器溫度300℃，載氣為高純氮?dú)?，流?.0mL/min，色譜柱為DB-1701毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm）,氫氣流速35.0 mL/min，空氣流速 120.0mL/min.。

性信息素組分分析采用提取物與標(biāo)準(zhǔn)化合物在GC上的保留時(shí)間相比較，根據(jù)提取物在質(zhì)譜儀檢測得到的質(zhì)譜圖與質(zhì)譜譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖相比較，最終確定柑桔潛葉蛾的性信息素組分。

1.4 風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)

（1）風(fēng)洞裝置。風(fēng)洞定向飛行試驗(yàn)均在本實(shí)驗(yàn)室自制的大型風(fēng)洞內(nèi)進(jìn)行。風(fēng)洞實(shí)驗(yàn)室溫度控制在25±1℃，相對濕度控制在65%～75%。

（2）風(fēng)洞測試。柑桔潛葉蛾性信息素化合物以及雌蛾性信息素腺體粗提物提取液的定向行為測定，均采用袖口式硅橡膠頭作為性信息素載體，試驗(yàn)前先將性信息素組分按合適的劑量制成誘芯，并將雌蛾腺體提取液裝入袖口式硅橡膠制成誘芯，放入風(fēng)洞內(nèi)。待測昆蟲針插在袖口式硅橡膠頭誘芯支架上，每個(gè)誘芯只使用1次。求偶雌蛾關(guān)在自制的10cm×10cm×10cm的小養(yǎng)蟲籠中，置于風(fēng)洞中。

（3）雄蛾定向行為測試。取處于2日齡暗期的雄蛾，暗期開始前，先將待測雄蛾單頭置于2.5cm×10cm的玻璃試管內(nèi)，塞上棉花，在測試前0.5-1h之前轉(zhuǎn)移到風(fēng)洞所在的房間，使之適應(yīng)測試環(huán)境。試驗(yàn)開始時(shí)，分別將雌蛾、腺體提取物的硅橡膠誘芯和合成信息素硅橡膠誘芯放在風(fēng)洞的上風(fēng)口，幾分鐘后，將雄蛾放在下風(fēng)口，在下風(fēng)口的適當(dāng)位置，放一個(gè)支架，將玻璃管水平放在支架上，使雄蛾的位置正好與氣味源在一水平上。去掉玻璃管的棉花，讓雄蛾自由運(yùn)動(dòng)，每頭雄蛾只使用1次。本實(shí)驗(yàn)取雄蛾行為反應(yīng)明確且易觀察的環(huán)節(jié)作為雄蛾對誘芯產(chǎn)生行為反應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)。即按起飛、定向飛行、飛行至風(fēng)洞1/2距離以上、接近誘芯(10 cm以內(nèi))及降落到氣味源上的昆蟲數(shù)量等步驟記錄，每個(gè)處理一般重復(fù)3次，每次重復(fù)至少測試10頭雄蛾。

2 結(jié)果與分析

（1）信息素組分GC-MS鑒定結(jié)果。根據(jù)提取物在質(zhì)譜儀檢測得到的質(zhì)譜圖與質(zhì)譜譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖相比較，對柑桔潛葉蛾提取物和合成標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行GC-MS分析，柑桔潛葉蛾提取物全掃描總離子質(zhì)譜圖(圖 1)中有1個(gè)峰（1號峰）的質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中Z7Z11-16ALD 的質(zhì)譜圖（圖2）基本一致，其特征離子比例和保留時(shí)間也基本一致，所以推斷為Z7Z11-16ALD。

圖1 柑桔潛葉蛾腺體提取物總離子質(zhì)譜圖

圖2 （Z,Z）-7,11-十六碳二烯醛質(zhì)譜圖

（2）信息素組分鑒定 GC分析。通過GC分析，結(jié)果表明柑桔潛葉蛾腺體提取物的主要成分與(Z,Z)-7,11-十六碳二烯醛的保留時(shí)間（14.315 min）一致（ 圖 3、4），在柑桔潛葉蛾腺體提取液中加入(Z,Z)-7,11-十六碳二烯醛標(biāo)準(zhǔn)化合物，可使對應(yīng)組份的所得峰面積成比例增加，沒有出現(xiàn)其他的峰。從而證實(shí)處于召喚狀態(tài)下的柑桔潛葉蛾雌蛾性信息素腺體活性成分為Z7Z11-16ALD。

圖3 柑桔潛葉蛾提取物氣相色譜圖

圖4 標(biāo)準(zhǔn)化合物（Z,Z）-7,11-十六碳二烯醛氣相色譜圖

（3）雄蛾在風(fēng)洞中對求偶雌蛾、腺體提取物和合成性信息素的行為反應(yīng)。結(jié)果表明，雄蛾的在風(fēng)洞中對求偶雌蛾、腺體提取物和合成信息素誘芯的行為均有反應(yīng)，能使絕大部分雄蛾產(chǎn)生起飛、定向、飛至風(fēng)洞2／3距離以上，接近誘芯及降落至氣味源的完整行為過程。在選擇性測試中，雄蛾降落在求偶雌蟲、腺體提取物和的個(gè)體比例沒有顯著差異。說明以上的柑桔潛葉蛾性信息素分析是準(zhǔn)確有效的組分。

3 結(jié)語

本試驗(yàn)通過單個(gè)雌蛾腺體微量分析技術(shù)，鑒定出柑桔潛葉蛾(中國種群)雌蛾腺體內(nèi)含有1種主要且具有生物活性的組分為(Z,Z)-7,11-十六碳二烯醛。

風(fēng)洞試驗(yàn)結(jié)果顯示，人工合成的柑桔潛葉蛾性信息素誘芯、雌蛾和腺體提取物的誘蛾效果沒有差異?？梢詰?yīng)用于柑桔潛葉蛾的預(yù)測預(yù)報(bào)和大量的誘捕防治，人工合成的柑桔潛葉蛾性信息素誘芯的最佳劑量、載體類型，是否增加抗氧化劑、光穩(wěn)定劑等需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。