甘藍枯萎病菌REMI轉化體系的建立

馮建海， 張 瑋， 李興紅， 燕繼曄＊， 黃金光，3＊

（1.青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；2.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097；3.山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109）

甘藍枯萎病菌REMI轉化體系的建立

馮建海1， 張 瑋2， 李興紅2， 燕繼曄2＊， 黃金光1，3＊

（1.青島農業大學農學與植物保護學院，青島 266109；2.北京市農林科學院植物保護環境保護研究所，北京 100097；3.山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，青島 266109）

建立高效、穩定的甘藍枯萎病菌REMI轉化體系，為進一步獲得特定表型突變體及基因功能研究建立技術儲備。利用REMI（restriction enzyme mediate intergration）轉化方法，將線性化的含有潮霉素抗性基因的pUCATPH質粒轉化甘藍枯萎病菌A6菌株的原生質體，摸索獲得轉化子最適的潮霉素篩選濃度以及不同限制性內切酶和酶量對轉化效率的影響；利用PCR（polymerase chain reaction）技術對潮霉素抗性轉化子進行驗證。結果表明轉化子的最適潮霉素篩選濃度為50μg／mL；轉化效率較高的限制性內切酶為HindⅢ，并且轉化效率最高時的酶量為20U。利用該轉化體系構建了含1 050個轉化子的甘藍枯萎病菌轉化子庫，對轉化子進行Southern驗證，證明該轉化體系是可行的。

甘藍枯萎病菌； REMI； 轉化子庫

由甘藍枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans）引起的甘藍枯萎病是一種典型的土傳病害［1］，受害的甘藍在苗期即可發病，最初表現為葉脈變黃，隨著病情的發展，整葉或全株變黃，進而植株變小而萎蔫，最后枯死，剖開植株的短縮莖可見維管束明顯變褐。該病在大葉芥上的癥狀與甘藍相似，也表現為萎蔫、黃化及枯死［2］。1895年，Smith在美國首次發現甘藍枯萎病，該病害在美國東北部蔓延，隨后在加拿大、日本等國家也相繼報道［3－6］，近年來，該病害在我國北京、河北等地發生并迅速蔓延［7］。生產上除抗病品種選育外，至今沒有其他的有效防治措施。

基于甘藍枯萎病危害日趨嚴重的現狀，從分子水平上研究其致病機理，已經愈來愈受到重視。甘藍枯萎病菌REMI轉化體系的建立正是為下一步致病相關基因的研究奠定基礎。限制性內切酶介導的整合技術（REMI）是1991年由Schiestl等在研究釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的過程中創立的［8］。目前，REMI技術已經廣泛應用于真菌尤其是植物病原真菌的研究［9－11］，并因其高效性已成為病原真菌研究中的一種重要手段。本研究在掌握甘藍枯萎病菌原生質體的制備和再生基礎上［12］，建立高效的甘藍枯萎病菌REMI轉化體系和構建甘藍枯萎病菌突變體庫，從而為致病相關基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

甘藍 枯 萎 病 菌 （Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans）A6菌株，分離自北京市延慶縣甘藍產區，保存在北京市農林科學院植物保護環境保護研究所植物病害綜合防治研究室；用于轉化的質粒pUCATPH由中國農業大學彭友良教授惠贈，美國康奈爾大學構建。

1.2 主要試劑及培養基

1.2.1 主要培養基

PDA培養基：200g馬鈴薯，20g葡萄糖，15g瓊脂，蒸餾水定容至1L。

CM液體培養基：6g酵母提取物，3g酸水解干酪素，3g酶水解干酪素，10g蔗糖，蒸餾水定容至1L。

液體再生培養基（LR）：1g酵母提取物，1g酶水解干酪素，342g蔗糖，蒸餾水定容至1L。

固體再生培養基（SR）：向1LLR培養基中加入15g瓊脂。

以上培養基均需1×105Pa滅菌20min。

1.2.2 主要試劑

STC：1.2mol／L 山梨醇，10mmol／L Tris－HCl（pH 7.5），50mmol／L CaCl2。

PTC：60% 聚乙二醇（PEG 3350），10mmol／L Tris－HCl（pH 7.5），50mmol／L CaCl2。

0.7mol／L NaCl：40.9g NaCl，ddH2O 定容至1L。

崩潰酶（driselase）：20mg／mL，用預冷0.7mol／L NaCl配制，2 000g離心10min，上清液經20μm微孔濾膜過濾后分裝，－20℃保存備用。

崩潰酶、酶水解干酪素（casein enzymatic hydrolysate）、酸水解干酪素（casein acids hydrolysate）為美國Sigma公司產品；山梨醇（sorbitol）、PEG3350為美國Amresco公司產品；限制性內切酶HindⅢ、EcoRI、DNA Marker、瓊脂粉為寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）產品；其他常規生化試劑國產分析純，購自北京化學試劑公司。

1.3 轉化方法

向50mL離心管中分別加入150μL原生質體，2μg線性化質粒pUCATPH，限制性內切酶HindⅢ，用STC補足至每管300μL，冰上放置20min。每管逐滴加入2mL PTC溶液，冰上靜置20min。每管各加入25mL預冷的STC溶液，顛倒混勻，4℃，2 000g離心15min，棄上清，每管加入3mL LR培養基，28℃靜置培養12～18h后，向培養液中加入15mL 50℃左右的SR再生培養基，混勻后鋪板，凝固后在平板表面覆蓋10mL 50℃左右含有50μg／mL Hygromycin B的1.5%水瓊脂。

1.4 潮霉素敏感性測定

用滅菌的牙簽分別挑取A6菌絲接種到含有不同濃度潮霉素B的PDA培養基上，濃度梯度設定為10、20、30、40、50、60、70、80μg／mL，28 ℃培養5d后測量菌落直徑，每個處理重復3次。

1.5 不同酶量對轉化效率的影響

利用不同酶量的限制性內切酶HindⅢ介導轉化 A6菌株，酶量分別為5、10、15、20、25、30、35U，其他條件保持不變，重復3次。

1.6 不同限制性內切酶對轉化效率的影響

分別用HindⅢ和EcoRI介導轉化A6菌株。所用酶量均是20U，其他條件保持不變，重復3次。

1.7 轉化子的PCR鑒定

隨機挑取轉化菌株，以未轉化的野生型菌株A6作對照。提取野生菌株和轉化菌株的基因組DNA，用根據潮霉素磷酸轉移酶基因設計的引物（HPTF：5′－CGACAGCGTCTCCGACCTGA－3′， HPTR：5′－CGCCCAAGCTGCATCATCG AA－3′）進行PCR擴增。PCR擴增反應程序為：94℃，3min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，50s；32個循環，最后72℃延伸10min。PCR反應總體系為25μL，其中模板1μL，2× PCR Mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，ddH2O 10.5μL。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 Southern blot驗證

隨機挑選9個轉化子，以野生型菌株A6作為對照。大量法提取轉化子和野生型菌株的基因組DNA，用潮霉素磷酸轉移酶基因作為探針，HindⅢ酶切轉化子和野生型菌株DNA，用HindⅢ酶切的λDNA作為Marker進行Southern blot驗證。

1.9 轉化子的遺傳穩定性鑒定

甘藍枯萎病菌轉化菌株經過5代單孢繼代培養后，轉接到添加潮霉素B的PDA培養基平板上，觀察生長情況。

2 結果與分析

2.1 甘藍枯萎病菌對潮霉素B的敏感性測定

通過測量野生型A6菌株在添加不同濃度潮霉素B的PDA培養基上的菌落直徑，發現隨著潮霉素B濃度增大菌落生長速度逐漸減慢，在50μg／mL時菌株生長完全受到抑制（圖1）。

圖1 不同濃度潮霉素B對A6菌株生長速度的影響Fig.1 Influence of hygromycin B at different concentration on the growth of the strain A6

2.2 不同HindⅢ酶量對轉化效率的影響

由圖2可知，隨著酶量的增加，轉化子產生的個數也逐漸增多。當酶量超過20U后轉化效率沒有明顯提高。

2.3 不同限制性內切酶對轉化效率的影響

分別用HindⅢ和EcoRI兩種限制性內切酶介導轉化A6菌株，酶量均為20U／管。結果表明，HindⅢ介導產生的轉化體個數平均為25個／管，而EcoRI平均僅為10個／管。

圖2 不同酶量對轉化效率的影響Fig.2 Influence of enzymes with different amount on transformation efficiency

2.4 轉化子的PCR鑒定

分別以野生型A6菌株和轉化子基因組DNA為模板進行PCR檢測。如圖3所示，在隨機挑選的9個轉化子的基因組中都能夠擴增得到預期大小約為750bp的目的片段，而A6菌株基因組DNA中未擴增到任何條帶，表明這些轉化子基因組中確實含有潮霉素磷酸轉移酶基因。初步驗證了潮霉素磷酸轉移酶基因已轉化并整合入野生型菌株的基因組DNA中。

圖3 轉化子的PCR鑒定Fig.3 Identification of the transformants by PCR

2.5 轉化子庫的構建及Southern blot驗證

利用建立的REMI轉化體系，用HindⅢ轉化A6，共獲得1 050個轉化子。隨機選取9個轉化子進行Southern blot驗證，轉化子中都含有潮霉素磷酸轉移酶基因并且大部分為單位點插入（圖4）。

圖4 轉化子的Southern blot驗證Fig.4 Verification of the transformants by Southern blot

2.6 轉化子的遺傳穩定性鑒定

甘藍枯萎病菌轉化菌株經過5代單孢繼代培養后，轉接到添加潮霉素B的PDA培養基平板上，仍然生長良好，表明試驗所獲得的轉化菌株潮霉素B抗性能夠穩定遺傳。

3 結論與討論

制備原生質體是進行絲狀真菌遺傳轉化的關鍵因素，在Cochliobolusheterostrophus［8］、Aspergillusalternate［10］中，已成功得到轉化所用的原生質體產量均在106個／mL，因此獲得一定濃度、純度和活力的原生質體是絲狀真菌進行分子遺傳學研究的基礎和前提。本研究在掌握甘藍枯萎病菌原生質體的制備和再生基礎上［12］，利用REMI轉化技術將含潮霉素磷酸轉移酶基因的質粒成功整合到了甘藍枯萎病菌基因組中。

潮霉素對不同真菌的影響不同，對木霉的篩選濃度為250μg／mL［13］，稻瘟病菌的篩選濃度為300μg／mL［14］，本試驗發現當潮霉素B濃度大于50μg／mL時，甘藍枯萎病菌分生孢子的萌發完全受到抑制且菌絲幾乎不能生長，因此試驗采用50μg／mL作為甘藍枯萎病菌的潮霉素篩選濃度。本研究所用質粒含有很多酶切位點，其中限制性內切酶HindⅢ和EcoRI在絲狀真菌REMI轉化中使用效率較高，因此本試驗對這兩種酶的轉化效率做了比較，發現用限制性內切酶HindⅢ的轉化效率相對較高。通過不同酶量轉化效率的比較，發現當酶量超過20U后轉化效率沒有明顯提高，因此本研究選用酶量為20U。但有文獻曾報道隨著酶量的增多，轉化子的拷貝數也會相應增多［15］。

REMI轉化因在真菌轉化上的效率遠遠大于傳統方法的轉化效率，已經越來越多地被應用到真菌轉化中，但同時也存在一些局限性，如轉化機理還不夠明確，轉化過程中多拷貝插入率較高等。目前在真菌中，一些酵母菌的Agrobacteriumtumefaciens介導轉化（ATMT）首先獲得成功，隨后ATMT轉化技術已擴展到一些絲狀真菌的轉化。相對于REMI轉化，ATMT轉化可以省略原生質體制備的過程，并且在一些真菌轉化上可以單拷貝地隨機插入到染色體中，該項工作不僅為絲狀真菌的轉化提供了新的途徑，而且T－DNA轉化在插入突變和標記基因方面具有相當的潛力，提供了新的可能途徑。本試驗在研究REMI介導整合轉化的基礎上將進一步探討A.tumefaciens介導的方法，建立起了一套完整、有效的尖孢鐮刀菌A.tumefaciens介導的遺傳轉化體系。

另外試驗中還存在一些問題，如獲得單拷貝的轉化子效率相對不高，轉化穩定性尚有待提高。因此還需要進一步優化轉化條件，提高轉化效率。

本研究通過構建REMI轉化子庫，對獲得的部分轉化子進行Southern blot驗證分析，確認轉化子中含有潮霉素磷酸轉移酶基因并且大部分為單位點插入，并篩選出了一批產孢和致病力發生明顯變化的轉化子，這對克隆甘藍枯萎病菌產孢和致病相關基因具有重要意義。

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Construction of transformation system inFusarium oxysporumf.sp.conglutinansby REMI

Feng Jianhai1， Zhang Wei2， Li Xinghong2， Yan Jiye2， Huang Jinguang1，3
（1.CollegeofCropProtectionandAgronomy，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.InstituteofPlantandEnvironmentProtection，BeijingAcademyofAgricultureand ForestrySciences，Beijing100097，China；3.KeyLabofIntegratedCropPest ManagementofShandongProvince，Qingdao266109，China）

Establishment of an efficient and stable REMI transformation system inFusariumoxysporumf.sp.conglutinansby restriction enzyme－mediated integration is a key step to build a transformants library for further studying mutants with specific phenotype and gene function.By REMI transformation method，the linearized pUCATPH plasmid containing the hygromycin resistance gene was transformed into the protoplasts ofF.oxysporumstrain A6.The hygromycin concentration to transformants was optimized，and different restriction enzymes were tested on the transformation efficiency.Hygromycin－resistant transformants were checked by PCR.Hygromycin at 50μg／mL was optimal for screening transformants.Transformation efficiency byHindⅢ was higher than other enzymes，and reached to the highest at 20 U.A library with1 050 transformants was built by the REMI transformation system.The Southern blot results proved the feasibility of the transformation system.

Fusariumoxysporumf.sp.conglutinans； REMI； transformants library

S 436.35

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2013.03.020

2012－08－28

2012－09－24

公益性行業（農業）科研專項（2000903049）；北京市農林科學院植保環保所創新基金（CXJJ200901）；山東省“泰山學者”建設工程專項經費，青島農業大學高層次人才科研基金（631217）

＊ 通信作者E－mail：jghuang＠qau.edu.cn