耐亞胺培南鮑曼不動桿菌苯唑西林基因型分析

雷 紅，董 梅，劉 敏，孫敏霞，孟祥紅，佟愛華，劉 昕

解放軍第309醫院 檢驗科，北京 100091

碳青霉烯酶是鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的重要機制之一。鮑曼不動桿菌產生的碳青霉烯酶主要包括兩大類酶，即D類苯唑西林(oxacillin，OXA)酶和B類金屬β-內酰胺酶[1-2]。其中OXA型碳青霉烯酶是引起世界范圍內鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥的最重要原因[3]。OXA型碳青霉烯酶是能水解苯唑西林的β-內酰胺酶，屬于Ambler分子分類中的D類酶，該類酶可以水解青霉素類、頭孢菌素、碳青霉烯類和氨曲南等抗菌藥物，導致產酶細菌對這些抗菌藥物耐藥[4]。本文研究耐亞胺培南鮑曼不動桿菌的碳青霉烯酶基因型，對臨床合理應用抗菌藥物和醫院感染監控提供科學依據。

材料和方法

1 菌株來源 收集解放軍第309醫院2010年4-12月住院患者的非重復耐亞胺培南鮑曼不動桿菌68株，分離菌株均使用甘油肉湯菌種保留管-20℃保存備用。

2 主要儀器和試劑 PCR擴增儀(Bio-Rad)，電泳儀(北京六一儀器廠)，LB肉湯，瓊脂糖(Biowest，西班牙)，ExTaq DNA聚合酶等。

3 多重PCR引物 所用PCR引物均由生物工程(上海)有限公司合成，各引物序列見表1。多重PCR擴增體系及程序見表2。

多重PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性 25 s，52℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，30 個循環；72℃再延伸6 min。同時以無菌水為陰性對照。

4 DNA模板制備 挑取單個菌落轉接至LB肉湯中，37℃恒溫振蕩培養8 h。取2.0 ml菌液，采用加熱煮沸方法制備DNA模板。制備好的模板置于-20℃凍存。

5 PCR產物測序及序列比對 將OXA-23和唯一1株OXA-58陽性菌株，采用PCR檢測，擴增產物由北京六合華大基因科技股份有限公司進行雙向測序，并采用DNASTAR軟件把測序結果與Genbank進行比對。

表1 多重PCR引物序列及預計PCR產物片段長度Tab.1 Primers used in PCR and length of PCR product fragments

表2 50μl多重PCR反應體系Tab.2 PCR amplification in 50μl

結 果

1 多重PCR擴增OXA基因 共擴增68株臨床分離的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌，7株菌只攜帶OXA-51基因(檢出率為10.29%)，60株菌同時攜帶OXA-51和OXA-23基因(檢出率為88.24%)，僅有1株菌株同時攜帶OXA-51和OXA-58基因(檢出率為1.47%)，未擴增到OXA-24基因，見圖1。

2 OXA-23基因測序和比對 對PCR純化產物進行測序，在Genbank經Blast比對發現該基因片段與序列號JQ002680.1基因片段的blaOXA-23基因序列的同源性均達99%，表明菌株中blaOXA-23基因是高度保守。

3 OXA-58基因測序和比對 對PCR純化產物進行測序，在Genbank經Blast比對發現該基因片段與序列號HQ219687.1基因片段的blaOXA-58基因序列同源性達99%。

圖1 多重PCR檢測68株鮑曼不動桿菌OXA基因電泳圖第3和第16號株僅具有OXA-51基因，其余14株均同時具有OXA-51和OXA-23基因Fig.1 PCR showing electrophoresis for OXA genes in 68 imipenemresistant Acinetobacter baumannii strains OXA-51 gene in No.3 and 16 strains and OXA-51 and OXA-23 genes in No.14 strain

討 論

鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制是該菌產D類碳青霉烯酶[5-6]。D類碳青霉烯酶(OXA型)屬絲氨酸蛋白酶，通常水解苯唑西林、甲氧西林等。1993年Paton等報道世界上第1例鮑曼不動桿菌產碳青霉烯酶活性的β-內酰胺酶，并命名為ARI-1，該菌可水解亞胺培南，水解活性不被克拉維酸和EDTA所抑制。該菌株來源于1985年蘇格蘭愛丁堡皇家醫院1例病人的多重耐藥鮑曼不動桿菌分離物。直到2000年，Donald等[7]對ARI-1酶的氨基酸序列進行分析，將ARI-1重新命名為OXA-23。從此，在世界范圍內相繼報道耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌攜帶有OXA基因。根據氨基酸序列的同源性分類，D類酶分為9個亞組[8-9]，第1亞組包括OXA-23、OXA-27和 OXA-49； 第 2亞 組 OXA-24、OXA-25、OXA-26、OXA-40和OXA-72；第3亞 群 由OXA-51、OXA-64——OXA-71、OXA-75——OXA-78、OXA-83、OXA-84、OXA-86——OXA-89、OXA-91、OXA-92、OXA-94 和OXA-95組成，第4亞組僅具有OXA-58；第5亞組為染色體編碼酶OXA-55和OXA-SHE組成；第6亞組由OXA-48、OXA-54；第7亞組由OXA-50家族組成，包括OXA-50a——OXA-50d；第8亞組包括 OXA-60家 族 (OXA-60a——OXA-60d)；第 9亞 組為OXA-62。然而經臨床研究發現9亞組D類酶中，臨床分離鮑曼不動桿菌主要包括前4個亞組，其 代 表 酶 分 別 為 OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58型。

本文通過研究前4個亞組OXA基因發現，在68株分離于臨床患者的耐亞胺培南鮑曼不動桿菌中，全部攜帶OXA-51基因(檢出率為100.0%)，只攜帶OXA-51基因有7株(檢出率約為10.29%)；同時攜帶OXA-51和OXA-23基因有60株(檢出率約為88.24%)；只有1菌株同時攜帶OXA-51和OXA-58基因(檢出率約為1.47%)；未擴增到OXA-24基因。本研究結果表明解放軍第309醫院耐亞胺培南鮑曼不動桿菌攜帶OXA基因以OXA-51+OXA-23基因為主。此結果不僅與Woodford等[10]報道相一致，也與國內大多數文獻報道相一致[2,11-13]，其中王輝報道1999-2002年北京、廣州兩地對亞胺培南耐藥的不動桿菌研究，絕大多數菌株產OXA-23型碳青霉烯酶；沈定霞報道絕大多數鮑曼不動桿菌含有OXA-23型碳青霉烯酶。由此說明中國大多數地區耐亞胺培南鮑曼不動桿菌以產OXA-51+OXA-23型碳青霉烯酶菌株為主要的流行株。OXA-58首次發現于2003年法國圖盧茲分離的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌，該酶可水解青霉素、苯唑西林和亞胺培南，但不水解超廣譜β-內酰胺類抗菌藥物。OXA-24基因位于染色體上，只能發生垂直傳播，即親代傳遞給子代，可以水解亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類抗菌藥物，但對苯唑西林的水解能力較弱或者不水解。本次研究未檢測到OXA-24基因，與國內報道相一致[2,11]。因為對亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌具有不同的OXA耐藥基因型，那么攜帶不同的OXA耐藥基因型的鮑曼不動桿菌對亞胺培南耐藥水平是否不同，有待進一步研究。

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2 王輝，孫宏莉，廖康，等.北京和廣州地區四家醫院不動桿菌碳青霉烯酶基因型研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2005，28（6）：636-641.

3 湯鳳珍，張偉紅，陳惠玲．碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因型研究［J］.中國感染與化療雜志，2010，10（5）：354-356．

4 王輝，陳民鈞．碳青霉烯酶：未來困擾我們的難題［J］.中華內科雜志，2003，42（5）：354-356．

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11 張偉紅，葉惠芬，楊銀梅，等．耐亞胺培南鮑曼不動桿菌耐藥表型和碳青霉烯酶基因型分析［J］.中國感染與化療雜志，2011，11（1）：45-48．

12 楊培洪，凌保東．耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌OXA酶基因研究［J］.中國抗生素雜志，2011，36（9）：703-707．

13 沈定霞，閆中強，羅燕萍，等．檢測多藥耐藥鮑氏不動桿菌的碳青酶烯酶及整合酶基因［J］.中華醫院感染學雜志，2008，18（1）：11-13．