紫甘薯的有益成分及其提取純化方法研究

郭維圖

（東南醫藥生物工程技術研究所，福建廈門361021）

0 引言

紫甘薯又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色。紫甘薯中含有豐富的蛋白質和18種易被人體消化和吸收的氨基酸，還富含維生素C、B、A等8種維生素和磷、鐵等10多種天然礦物質元素。其中，鐵和硒含量豐富，而硒和鐵是人體抗疲勞、抗衰老和補血的必要元素，特別是硒被稱為“抗癌大王”，易被人體吸收，可留在血清中，修補心肌，增強機體免疫力，清除體內自由基，抑制癌細胞中DNA的合成和癌細胞的分裂與生長，可預防胃癌、肝癌等癌病的發生。紫甘薯富含纖維素，可增加糞便體積，促進腸胃蠕動，清理腸腔內滯留的黏液、積氣和腐敗物，排出糞便中的有毒物質和致癌物質，保持大便暢通，改善消化道環境，防止胃腸道疾病的發生。

湖北紫鑫生物科技有限公司在黃金山投資建設了目前全國最大的紫甘薯萃取花青素項目。此項糧食深加工項目規劃占地53000多m2，總投資1.5億人民幣。一期工程建成后，年處理紫甘薯10000t，年產花青素150t，總產值2億人民幣；二期工程完成后年處理紫甘薯30000t，年產花青素450t，總產值可達10億人民幣。

1 紫甘薯富含花青素

從紫甘薯的顏色就可以判斷其含有豐富的花青素。法國科學家馬斯魁勒博士發現花青素是天然強效自由基清除劑，可以消除體內自由基，這些自由基是衰老和癌癥的元兇。花青素對100多種疾病有預防和治療作用，被譽為繼水、蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質之后的第7大必需營養素。花青素是目前發現的防治疾病、維護人類健康最直接、最有效、最安全的自由基清除劑，其清除自由基的能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍。所以，紫甘薯的營養價值要遠高于其他薯類。

紫甘薯是甘薯的一個特殊品種類型，因其薯肉富含紅色素，作為一種重要天然色素源而引起許多學者的關注。紫甘薯紅色素（PSPC）是從紫甘薯的塊根和莖葉中浸提出來的一種天然紅色素，色澤鮮亮自然，無毒、無特殊氣味，具有多種營養、藥理和保健功能，是一種理想的天然食用色素資源。

目前，天然著色劑存在的最大問題就是在產品中多數不穩定，因此在一定程度上影響了其在工業中的應用。有資料報道，酰基化的色素分子可以提高色素的穩定性。而紫甘薯色素分子正是酰基化的色素分子，所以其穩定性較強，應用前景廣泛。

1.1 花青素的理化性質

原花青素又稱為縮合單寧，是自然界中廣泛存在的聚多酚類化合物，具有多種生物活性，高效、低毒、生物利用度高，是近年來不斷研究開發的一種極強的體內活性功能因子，已廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域，與原花青素相關的植物學和農學性狀的研究、利用和改良正日益受到重視。

花青素分子量為449.2，花青素易溶于水、甲醇、乙醇等極性強的溶劑。紫甘薯花青素具有較好的熱穩定性，在60℃以下穩定性很好，保存率可達到100%。紫甘薯花青素具有較強的耐壓特性，在500MPa的壓力下處理15min后花青素的保存率仍能保持不變。不同pH值下的紫甘薯的花青素穩定性不同，在較強的酸性條件下（pH≤3），顏色及特征吸收光譜變化不太明顯。但在堿性條件下，花青素穩定性較差。花青素是水溶性色素，在酸性中顯紅色，中性顯紫色，堿性顯藍色或綠色不穩定。紫甘薯紅色素在不同介質中呈現不同的光譜特性。只有在酸性介質中，波長在530nm處才出現特征吸收峰。

紫甘薯色素對溫度和光敏感，高于60℃易于分解，日光、紫外光也能促使其分解，故應避光、陰涼保存。

Fe3+、Cu2+、Al3+離子對紫甘薯色素有較好的增色護色作用，Pb2+離子對紫甘薯色素的穩定性沒有影響，Zn2+離子對紫甘薯色素的穩定性影響較大。在針對食品添加劑、氧化劑、還原劑的研究中發現：蔗糖、苯甲酸鈉對紫甘薯色素穩定性沒有影響；NaNO2對紫甘薯色素破壞性極大；D-異抗壞血酸鈉對紫甘薯色素有很好的護色作用。紫甘薯色素對低濃度過氧化氫穩定性較好，對高濃度過氧化氫穩定性較差；Na2SO3對紫甘薯色素的穩定性影響很大，加入Na2SO3會使紫甘薯色素的吸光度急劇下降。

1.2 花青素的用途

1.2.1 花青素的保健功能

花青素通常具有以下保健功能：

1.2.1.1 視力保護者

糖尿病性視網膜病是糖尿病的征兆，它是眼睛毛細血管微出血引起的，是成年盲人的常見病因。花青素可用來防止糖尿病患者在白內障手術后引起的并發癥。

1.2.1.2 消除水腫

水腫是血液中的水分、電解質等滲進了人體組織引起的，它通常表現為受傷部位腫脹。坐得過久的健康人會有水腫，婦女月經前會有水腫，運動受傷經常引起水腫，某些手術后可能有水腫，一些疾病也能導致水腫。研究表明，每天服用一次花青素，可以明顯緩解水腫現象。

1.2.1.3 皮膚美容

歐洲人稱花青素為青春營養品，皮膚維生素，口服化妝品。因為它能恢復膠原蛋白活力，使皮膚平滑而有彈性。膠原蛋白是皮膚的基本成分，并且是一種使身體成為一個整體的膠狀物質。維生素C是生化合成膠原蛋白必要的營養品，花青素能使更多的維生素C生效，這意味著，維生素C可以更容易地去完成其所有功能（包括產生膠原蛋白）。花青素連接在膠原蛋白上，可以阻止那些破壞膠原蛋白的酶的危害。花青素不僅可以幫助膠原蛋白纖維形成交聯結構，而且可以幫助恢復因受傷和自由基所引起的過度交聯的損害。過度交聯會使結締組織窒息和硬化，從而使皮膚起皺紋和過早老化。花青素還可以保護人體免受陽光傷害，防止輻射傷害，促進治愈牛皮癬和壽斑。花青素也是局部施用的皮膚霜的極好添加劑。

1.2.1.4 降低膽固醇

膽固醇是細胞膜的基本組成成分，對于產生和促進脂肪酸的輸送來講，它起了關鍵作用。但是，過多的膽固醇是一個潛在的危害。花青素和維生素C的組合可以使膽固醇分解，成為膽汁鹽，進而排除體外。花青素加快了有害的膽固醇的分解和排除。維生素C和花青素之間的協同關系再一次得到證實。

1.2.1.5 心臟保護劑

花青素不僅能夠幫助恢復皮膚彈性，而且也可以幫助關節、動脈以及其他組織（如心臟等）維持正常功能。血管系統負責血液流動，把血液送到所有細胞和組織。因此，不管是從長期和短期效果來看，花青素都是至今發現的最好的心臟保護劑。花青素也可抑制組胺的產生，因而可減輕炎癥，幫助動脈抗拒那些引發心血管病的誘變因素的沖擊。

1.2.1.6 改善大腦功能

花青素可以幫助增進記憶力，減緩衰老以及中風的風險。甚至在中風發生之后，花青素能幫助改善記憶力和大腦功能，這個事實已被臨床研究證明。

1.2.1.7 防止其他疾病

花青素不僅可以幫助減緩心血管發炎，也可幫助治療許多疾病，例如過敏、氣喘、支氣管炎、花粉熱、類風濕動脈炎、運動受傷、壓力潰瘍等。人體發炎時要釋放出一種名叫組胺的化合物，它可誘發上述疾病的種種癥狀。花青素抑制產生組胺需要的酶，防止生成組胺，從而減輕發炎。花青素是組胺的著名的抑制劑，但它并不阻礙其他的酶產生。花青素也可防止靜脈曲張帶來的包括疼痛、瘙癢、燒傷、疲勞等。嚴重的靜脈曲張能引起心臟病、中風、血栓性靜脈炎、肺栓塞等。

1.2.2 食品行業中的應用

紫甘薯的紅色素耐熱性好，主要作為食品的紅色至紫紅色著色劑而添加到食品中。因屬于天然無毒制品，故用量未作限量性規定，以滿足所需要的著色度為限。天然植物提取物作為調節身體健康的補充劑已成為時尚。紫甘薯紅色素有抗氧化、抗腫瘤等生理作用，因此可以作為保健食品的功能配料來使用。

1.2.3 化妝品行業中的應用

由于紫甘薯紅色素具有抗氧化、清除自由基等作用。因此，含紫甘薯紅色素的護膚品可抑制由于紫外線照射產生的氧自由基引起過氧化物的生成，對改善皮膚炎癥、抗氧化等有一定的作用。此外，它可代替工業中現在使用的合成色素，廣泛應用于口紅、胭脂、洗發水等化妝品。

2 花青素的提取

花青素的提取是目前花青素研究發展的熱點問題，也是花青素生產、投入使用的關鍵性環節。近年來，在傳統提取方法的基礎之上，一些憑借新技術或經過改良后的提取方法也開始嶄露頭角。

2.1 花青素的提取方法

2.1.1 有機溶劑萃取法

這是目前國內外使用最廣泛的提取方法。多數選擇甲醇、乙酮、丙酮等混合溶劑對材料進行溶解過濾，通過調節溶液酸堿度萃取濾液中的花青素。國內吳信子等用鹽酸—甲醇溶液提取，然后用紙層析法（中號）和柱層析法（聚乙酰胺）進行花色苷的分離。

目前，有機溶劑萃取法已成功地應用于諸如葡萄籽、石榴皮、藍莓等絕大多數含花青素物質的提取分離。有機溶劑萃取法的關鍵是選擇有效溶劑，要求既要對被提取的有效成分有較大溶解度，又要避免大量雜質的溶解。該方法原理簡單，對設備要求較低，不足之處是大多數有機溶劑毒副作用大，且產物提取率低。

2.1.2 水溶液提取法

有機溶劑萃取的花青素多有毒性殘留，且生產過程環境污染大。鑒于此，水溶液提取法應運而生。該方法一般將植物材料在常壓或高壓下用熱水浸泡，然后用非極性大孔樹脂吸附；或直接使用脫氧熱水提取，再采用超濾或反滲透，濃縮得到粗提物。此方法是Duncan和Gilmour在1998年發明的提取花青素的方法，設備要求簡單，但產品純度低。

天然色素的提取通常采用在一定溫度條件下，在提取罐中對溶劑進行浸泡、瀝濾、滲漉等方法。這些常規浸提法具有工藝和提取操作簡單、設備投資少、便于生產的優點，但也存在浸提時間長、勞動強度大、原料預處理能耗大、產品質量不太理想（色素溶解性差、色澤變化較大等缺陷），且大量溶劑回收容易導致產品生產成本的提高。

2.1.3 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取是利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響進行提取。這種方法產品提取率高，但設備成本過高。

孫傳經采用超臨界CO萃取法對從銀杏葉、黑加侖籽及葡萄籽中提取花青素的工藝進行了研究。該工藝中CO和改性劑可循環使用，對環境無污染。

2.1.4 微波提取法

該法于1986年被GanzlertE等人首先用于分離各種類型的化合物。國內李風英探討了微波技術對葡萄籽中原花青素提取量和分子結構的影響，為微波在葡萄籽中有效成分浸提方面的研究奠定了基礎。微波提取法是利用在微波場中，吸收微波能力的差異使得基體物質的某些區域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被萃取物質從基體或體系中分離，進入到具有較小介電常數、微波吸收能力相對較差的萃取溶劑中。該技術選擇性好，萃取率高，速度快，操作簡單，廢液排放量少。

2.1.5 超聲波提取法

超聲波提取法在20世紀50年代后逐漸應用于化學化工的生產過程中，且主要集中在植物中藥用成分、多糖以及其他功能性成分的提取等研究領域。超聲波提取法運用前景好、操作簡單、快速高效、生產過程清潔無公害。

2008年，Corrales等人開展的不同提取方法對葡萄中花青素的提取率影響的對比實驗結果表明：相同條件下與熱浸70℃提取相比，超聲波輔助提取花青素等酚類的效率可以提高50%以上。

2.1.6 微生物發酵提取法

此方法將生物發酵技術應用于花青素的提取之中，是生物科學與化工生產之間的超強滲透與有效結合。微生物發酵法利用微生物或酶讓含有花青素的細胞壁降解分離，使細胞體內花青素充分溶入到提取液中，從而增加提取的產率與速率。

王振宇采用微生物和纖維素酶降解大花葵細胞壁提取花青素就是可靠的研究實例，該方法的優點是操作穩定性及可靠性高，環境友好。

2.1.7 加壓溶劑萃取

加壓溶劑萃取法是通過加壓提高溶劑的沸點，進而使被提取物在溶劑中的溶解度增加，從而獲得較高的萃取效率。

Arapitsas等人在2008年采用了此技術優化了紫甘藍中花青素的最佳提取工藝。該法的優點是提取率高，但經濟成本亦較高。

2.1.8 亞臨界水提取技術

亞臨界水提取技術是最近幾年來的新成果，它的具體做法就是在適度壓力下，將水加熱到100℃以上，臨界溫度374℃以下的高溫，使水的極性隨溫度的變化而改變，然后對原材料中的花青素進行提取。

近兩年的研究實例有Luque-rodriguez等人采用動態過熱流體提取葡萄皮中的花青素，并優化了最佳提取工藝。對比于其他提取方法，亞臨界水提取方法清潔、有效、花青素提取量為傳統動態固液萃取的3倍，且產品性能更優，不足之處是工藝條件要求較高。

2.1.9 其他提取方法

其他提取方法包括高壓脈沖電場輔助提取、雙水相萃取、超高壓輔助提取。前2種可應用于蛋白質、核酸、多糖的提取研究，而超高壓輔助提取已成功應用于葡萄中花青素的提取，且對比發現高壓輔助提取花青素等多酚類的效率可以提高近50%。

2.2 試驗案例

2.2.1 酸性溶媒法

河北農業大學食品科技學院姚鈺蓉等曾研究報道，用甲酸對紫甘薯花青素進行提取的最佳條件為：料液比1:10，提取時間2h，提取劑甲酸濃度5%（v/v），提取溫度60℃，提取次數3次，粗提液經AB-8大孔徑樹脂純化后，得到色價為20.4的色素純品。這種方法提取的色素具有較好的耐熱、耐壓性能。

西南民族大學生命科學與技術學院陳煉紅等曾研究報道，采用溶劑提取法提取紫甘薯花青素時，溫度為60℃，提取劑中鹽酸和乙醇之比為2:3，料液比為1:5，浸提時間是40min，此時是紫薯花青素提取的最佳工藝，超聲波處理提高了提取效果。該方法時間短，在保證提取量的前提下，能保護花青素的穩定性，使其在提取時間內不發生變化，保持其有效成分，能夠達到實驗目的與要求的效果。

花青素易溶于水、甲醇、乙醇等極性強的溶劑。其中，甲醇不易于食用色素的提取。以水作為提取劑提取效率較低，干燥過程需較高溫度。因此，可以選擇乙醇作為提取劑。

在本次試驗中，有4種因素對花青素提取產生影響，分別是不同鹽酸與乙醇的提取劑的影響、溫度對提取效果的影響、物料比的影響、提取時間的影響。0.1%的HCl與95%的乙醇之比為重要的影響因素，當0.1%的HCl與95%的乙醇比為40:60時提取效果最好。當酸的含量繼續加大時，溶液中色素含量急劇減少。花青素結構中含有酚羥基，有酸性，而其結構中的吡喃雜環上的氧原子為4價，使其具有堿性。

提取劑的pH值過高或過低都會直接影響到色素的提取效果和色素的色調。升溫有利于色素的溶出，溫度為60℃時提取效果最好，如果繼續升高溫度，提取效果反而降低。可能是由于紫薯粉中含有一定量的淀粉，加熱使其糊化，進而阻止提取劑對色素的溶解，而且長時間處在較高溫度下對花青素的穩定性是很不利的。物料比也是一重要的影響，適當增加提取劑的用量有利于色素的溶出，可以提高花青素的浸提率，物料比1:40時浸提效果最好。

紫薯中花青素粗提液在可見分光530nm處有特征吸收峰，屬于花青素類物質。

2.2.2 超聲波輔助提取法

江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/中國農業科學院甘薯研究所鈕福祥、孫健、岳瑞雪、徐飛、朱紅等人采用以水、乙醇為介質結合超聲波技術對紫甘薯花青素提取工藝進行了研究。結果表明，水提法、乙醇提取法、循環超聲波水提法和循環超聲波乙醇提取法的最佳提取條件分別為60℃（4h）、40℃（8h）、60℃（1h）、60 ℃（2h），提取率分別為438.0mg/kg、624.1mg/kg、113.0mg/kg、682.6mg/kg，以循環超聲波乙醇提取法提取效果最好。對循環超聲波乙醇提取法的進一步研究表明，該方法最佳提取條件為提取溫度60℃、提取時間2h、提取次數2次、料液比1g:5mL，此時提取率為723.1mg/kg。

湖南化工職業技術學院實訓處李忠英采用超聲波輔助從紫甘薯中提取色素，以國產紫甘薯為原料，研究醇、有機酸溶液等溶劑提取紅色素的條件，考察提取液濃度、料液比、提取次數和浸取時間等因素的影響，通過單因素試驗和正交試驗確定超聲波提取最佳工藝：紫甘薯樣品預先浸泡4h，采用檸檬酸濃度10%，料液比1:30，超聲功率300W，提取時間25min，提取3次，紫甘薯中紅色素提取效果最佳。

2.2.3 微波輔助提取法

浙江萬里學院生物與環境學院楊華等選用微波提取方法從紫甘薯中提取花青素，其條件是以寧海紫甘薯粉為原料，研究了紫甘薯色素微波提取的工藝。通過正交實驗確定最佳提取工藝參數組合，結果表明最優工藝參數為微波功率700W，微波時間5min，液固比為22.5:1，pH為2.5。在此條件下，測得紫甘薯中花色苷的含量最高為236.3mg/100g。

長春工業大學化學工程學院王道武采用微波提取從紫薯中提取花青素，其條件為以紫薯為原料，在微波條件下萃取其花青素，探討了微波的輻射時間、溫度、液固比、提取劑濃度對紫薯花青素萃取的影響，并采用大孔樹脂AB-8純化提取液，將純化后的提取液進行反相高效液相色譜分析其成分。實驗結果表明，紫薯花青素微波最佳提取條件為：輻射時間60s，溫度40℃，液固比40:1，提取劑為1%的HCl、95%乙醇溶液，最佳酸醇比為50:50。

浙江大學化學系蔡吉清等人也采用微波輔助浸提紫色甘薯原花色素，最佳提取條件為：鹽酸的50%乙醇溶液，按1:70的料液比，微波處理70s。在此最佳實驗條件下，原花青素浸提量為0.96mg/g。此法具有重現性好、污染小、節省時間等優點。

2.2.4 超聲波與微波協同法

海南大學食品學院裴志勝等采用超聲波與微波協同從紫甘薯中提取花青素，其提取條件為以海南產紫參薯為原料，采用Box-Behnken中心組合試驗設計優化紫參薯花青素的超聲-微波協同萃取工藝。分別采用時間模式與恒溫模式2種方法，在單因素試驗基礎上，以花青素提取率為響應值，采用三因素三水平的響應面分析法進行試驗。結果表明：恒溫模式時，在額定超聲功率50W、料液比1:48（g/mL）、萃取時間283s、微波控制溫度46℃工藝條件下，紫參薯提取率達79.38%，比時間模式下的提取率要高10.63%，超聲-微波協同萃取的總花青素質量濃度為48.42mg/L，即4.37mg/g。

2.3 提取方法比較

一般來說，花青素色素的生產工藝主要有：

溶劑萃取法：用含有乙醇的酸性溶液提取后，再經過濾、濃縮等工藝得到最終的產品。

超濾法：將酸性溶液浸提、過濾后的溶液用超濾膜濃縮。

吸附精制法：將酸性溶液浸提、過濾后的溶液用大孔吸附樹脂吸附精制后，再濃縮或噴霧干燥得到最終產品。

上述3種方法各有利弊，其中，溶劑萃取法工藝簡單，但產品質量不理想，色素純度低、溶解性差；超濾法產品質量好，但對設備要求高、成本大，提取率低；吸附精制法雖然比溶劑萃取法復雜，但產品的質量高、回收率高。

中國農業大學許正虹采用微波提取試驗數據如表1所示。

表1 微波提取與常規提取的比較

綜上所述，李瑞麗等考察了微波輔助乙醇浸提法、超聲輔助乙醇回流浸提法和乙醇回流浸提3種方法對葡萄籽中的原花青素提取率的影響。結果顯示：在原花青素提取率方面，微波輔助法＞超聲輔助法＞乙醇回流法；在原花青素純度方面，微波輔助乙醇浸提法得到的原花青素粗品的純度較超聲輔助乙醇回流法和乙醇回流法的都高。目前，從紫甘薯中提取花青素的方法主要有浸提法、超聲波、酶法提取等。

國內學者陸國權等從1996年開始對紫甘薯色素的常規提取、純化和穩定性進行研究。但是，以上提取方法通常具有時間長、勞動強度大、原料預處理能耗大、熱敏性組分易破壞等缺點。微波作為一種新興的應用技術，近年來在植物化學領域得到廣泛應用，它具有穿透力大、選擇性強、加熱效率高等特點，由于它是一種瞬時穿透式加熱方式，在微波場的作用下，植物細胞壁被破壞，從而加快了萃取的速率，有效地提高了產品獲得率，尤其是微波連續提取，有利于規模化、產業化生產。因此，本實驗首次采用微波條件下萃取紫薯中的花青素的方法，以期改善傳統的浸提方法，為進一步開發紫薯功用提供參考。

2.4 影響微波提取的主要因素

2.4.1 提取劑的選擇

提取花青素有多種方法，一般使用純水、無機酸、有機酸、酸的醇溶液為提取劑。在相同條件下，酸化甲醇提取效果最好，但甲醇揮發性強，又有一定毒性，不宜用作天然色素提取劑。稀鹽酸和稀檸檬酸提取效果次之，它們對應的產率相近，但檸檬酸作為提取劑時，在微波加熱下提取效果較差。由于介電常數大的體系更適宜于用微波處理，而鹽酸的介電常數大于檸檬酸，所以，以檸檬酸作為提取劑的效果較明顯。本實驗體系選用鹽酸的乙醇溶液作為提取液。

2.4.2 乙醇體積分數的確定

在微波處理條件下，乙醇的浸提效果優于純水溶劑。以50%的乙醇浸提原花青素量最高，因為乙醇對原花青素的溶解度比水大，在浸泡過程中，乙醇等有機溶劑對細胞的破壞作用也比水強，在微波場中這種差異更加明顯。

2.4.3 料液比的確定

按實驗方法，取1g:40mL、1g:50mL、1g:60mL、1g:70mL、1g:80mL、1g:90mL、1g:100mL 的料液比加入體積分數50%的乙醇。隨著料液比的增大，原花青素浸提量逐漸增大，但到一定程度時，浸提量會有所下降，最佳料液比為1:70。這是由于大量溶劑吸收了微波致使提取溫度降低導致的。

2.4.4 微波處理功率與時間的確定

微波處理時間加長，加速了紫甘薯原花青素的浸提。但是，隨著時間的增加，微波的高效加熱使提取劑溫度迅速接近使花青素易分解的溫度（70～80℃）。目前花青素的各種提取方法，提取溫度均控制在45℃以下。微波處理70s后，提取液溫度略高于70℃。如果微波處理超過70s，糊化現象出現機率增高，導致提取劑和廢渣難以通過抽濾分離，浸提量反而下降，這可能是隨著微波處理時間的延長，使料液溫度增高，低聚原花青素被破壞。因此，確定微波處理時間宜為70s。

3 花青素的純化

色素純化的主要方法、色素粗提物的純化方法應根據色素化學成分、主要雜質成分來進行選擇，常用的方法有：柱層析法、膜分離法、溶劑分級沉淀法、兩相萃取法、酶法和結晶法等。試驗室小樣的分離純化常采用兩相萃取法、大孔樹脂吸附法、凝膠柱層析法、紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。其中，紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法兼具分離、定性定量分析檢測等用途。

工業化生產中常用的純化方法主要有柱層析法、兩相萃取法、膜分離法和溶劑分級沉淀法等。其中，柱層析法因分離效果好、成本低、操作簡便、易于大規模生產而被廣泛采用，是最具發展前景的色素純化方法。柱層析法是應用最為廣泛的一類色素純化技術，其基本原理是利用混合物各組成部分在某一物質中的吸附或溶解性能（分配）的不同或其他作用性能的差異，使混合物的溶液流經固定相時，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組分分開。根據固定相的不同，柱層析分離可分為許多種類，早期的固定相主要是氧化鋁和纖維素等，目前常采用大孔樹脂、離子交換樹脂、凝膠、硅膠等。

3.1 花青素的純化方法

3.1.1 大孔樹脂吸附層析

大孔吸附樹脂為吸附性和篩選性原理相結合的分離材料，是近10年來發展起來的一類有機高分子聚合物吸附劑，其吸附實質是表面分子因受作用力不均等而產生的表面吸附現象，這種吸附作用是由于范德華引力或生成氫鍵的結果，同時由于大孔吸附樹脂的多孔結構使其對分子大小不同的物質具有篩選作用。通過這種吸附和篩選，有機化合物根據吸附力的不同及分子量的大小，經一定溶劑洗脫而達到分離、純化、除雜、濃縮等不同目的。一般來說，對非極性大孔樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強；對極性大孔樹脂和極性較大的化合物，則用極性強的溶劑能更好地實現分離。

王華等人采用AmberliteXAD-7HP大孔吸附樹脂對葡萄果皮花色苷的純化進行了研究，確定的最優工藝條件為：色素溶液濃度1.2mg/mL，吸附時間60min，吸附流速1.5BV/h，pH值2.0，5%甲酸甲醇為解析劑，動態洗脫流速1.5BV/h；優化條件下所得產品的純度可達90.05%。

尹忠平等人以X-5樹脂對玫瑰茄紅粗提色素進行了純化，純化后色素色價從5.1提高到了32.2，樹脂經8次重復使用，吸附性能無明顯減弱，可以循環使用。

上官新晨等人以X-5樹脂純化紫紅薯色素，確定了上柱液pH值、吸附流速、解吸液、解吸液流速等優化工藝條件，為紫紅薯色素工業化純化生產提供了理論依據。

陳美紅等人選用NKA大孔樹脂對桑甚紅色素進行純化，優化了純化工藝，樹脂重復使用8次后吸附率僅降低2.8%，經純化后的色素為紫黑色粉末，其色價為452，是未純化的48.7倍。

王鋒等人以HP-20型大孔樹脂對黑花生衣色素進行了純化研究，優化了上柱量、上樣液pH值、上樣花色苷濃度、吸附溫度、洗脫劑等工藝參數，經純化色素的純度提高1倍。

黨蕊葉等人以X-5樹脂純化矮牽牛花紅色素、何志偉等人以D-101樹脂純化烏飯樹果色素、唐純翼等人以HPD-600樹脂純化爬山虎紅色素均取得了較好的分離純化效果和較高的回收率。

總體來看，大孔樹脂具有物理化學穩定性高、吸附選擇性強、不受無機物存在的影響、再生簡便、解析條件溫和、使用周期長、易于構成閉路循環、可循環使用、節省費用等優點，避免了有機溶劑提取分離造成的有機溶劑回收難、損耗大、成本高、易燃易爆以及對環境造成污染等缺點。因此，大孔樹脂廣泛應用于天然產物的分離。

3.1.2 離子交換樹脂層析

離子交換柱層析是以離子交換樹脂為固定相的層析分離方法，該方法使得固載在聚合物骨架上的功能基團所帶的可交換的離子在溶液中能發生解離，且可在較大的范圍內自由移動并擴散到溶液中，而溶液中的同類型離子也能從溶液中擴散到聚合物的網絡和孔內，當這2種離子的濃度差較大時，就產生一種交換的推動力使它們之間發生交換作用，濃度差越大，交換速度越快，利用這種濃度差的推動力使樹脂上的可交換離子發生可逆交換反應。

離子交換樹脂層析技術設備簡單、操作方便、生產連續化程度高，而且得到的產品往往純度高，同時成本低廉。因此，在天然產物提取分離研究與生產中的應用將日益廣泛。離子交換樹脂不僅用于水處理，而且廣泛應用于天然產物的分離純化，在天然色素的純化中有著廣泛的應用。由于花青素類色素是水溶性的，通常多以水或乙醇水溶液為提取液，因而粗提物中常見的雜質是多糖類、蛋白質類、有機酸類等，色素的純化就是要除去這些雜質。離子交換樹脂可除去糖、有機酸、無機鹽等，并可提高精制后色素的穩定性，因而常用于純化虎杖黃色素、葡萄皮色素等花青素類色素。

鐘瑞敏等人以弱酸性陽離子樹脂D152純化葡萄花色苷，結果表明吸附率超過95%，而且95%的乙醇洗脫速度較快、洗脫率高。

3.1.3 凝膠層析

凝膠層析也稱排阻層析，其工作原理是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析分離的固定相一般為交聯的多聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖），小分子物質能進入其內部，洗脫下來的速度慢，而大分子物質被排除在外部，洗脫下來的速度快，當混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。凝膠柱層析的突出優點是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，不需要有機溶劑，并且所要分離成分的理化性質能得到較好的保持。

Andersen等人用AmberliteXAD-7、SephadexLH-20對草莓花色苷的粗提物進行層析分離，HPLC驗證結果表明純化的效果很好。以X-5等大孔樹脂進行純化，再以SephadexG-50等進行凝膠柱層析精制，可獲得高色價色素。研究表明，凝膠層析對原花青素也有較好的純化效果。

3.1.4 硅膠柱層析

硅膠是一種常用的極性吸附劑，可作為分配層析中的支持劑，其吸附作用的強弱與硅醇基含量多少有關，主要優點是具有惰性、吸附量大和容易制備成各種類型的硅膠。硅膠柱層析是利用有機物各組分對同一吸附劑吸附能力的差異，并在流動相作用下不斷進行吸附和解吸，最終達到分離的目的。由于硅膠層析法操作簡單、成本低、分離效果好，已在花色苷的純化中得到了廣泛應用。

王霞等人采用硅膠層析技術對黑甜玉米黑色素進行了提取及純化工藝研究，結果表明純化后色素的純度顯著提高。

徐忠等人利用硅膠層析對千日紅花色苷酶法提取后的粗色素進行了分離純化，并研究徑長比和層析柱溫度2個因素對純化效果的影響，結果表明徑長比1:30、層析溫度35℃條件下純化效果較好。

3.1.5 膜分離法

膜分離技術是一種新興的高效分離技術，是以高分子膜為代表的一種新型的流體分離單元操作技術。該技術利用具有選擇透過性膜為分離介質，當膜兩側存在某種推動力（如壓力差、濃度差、電位差等）時，物料依據濾膜孔徑的大小而通過或被截留，達到分離、提純的目的。花青素類色素分離純化中常用的膜分離技術有超濾（UF）、反滲透（RO）、電滲析（ED）等。在花青素類粗提色素中，常夾雜著多糖、鞣質等大分子物質，膜分離可利用于選擇透過性膜將其去除，此外膜分離也可以除去鉛、砷、銅、汞等金屬離子，從而提高色價及穩定性。膜分離在常溫進行，條件溫和，能較好地保持色素的穩定性及其生理活性，且操作簡便，因而引起了科研人員和色素生產企業的廣泛關注。

Patil以酸化的乙醇提取紅蘿卜花色苷，再以膜分離的方法進行脫醇和濃縮提取液，花色苷的含量從372.6mg/L提高到625.8mg/L，再以滲透膜聯合蒸餾的方法濃縮至4850mg/L。

Lin等人以電滲析的方法從廢棄的紫蘇鹽水溶液中回收色素，除去了其中90%質量分數的NaCl，并回收了86%質量分數的紫蘇花色苷。

從已有的研究資料來看，膜分離純化的花色苷色價和透明度高，穩定性好，容易實現連續化生產，流程簡單，但對設備要求高，純化成本較高，色素回收率較低。

3.1.6 溶劑分級沉淀法

溶劑分級沉淀法純化色素主要是利用乙醇來進行，其原理是：多次反復調整乙醇濃度使大分子物質，如多糖、淀粉和蛋白質等物質沉淀，去除沉淀可得到較純的花色苷溶液。但從實際應用情況來看，此法操作過程繁瑣，且需消耗大量的乙醇，乙醇回收量大，且沉淀過程伴有色素的吸附和包夾，色素損失較大、回收率低。因此，該法在花色苷分離純化實際生產中應用較少。

3.1.7 兩相萃取法

該法利用色素與雜質在兩相溶劑中分配系數的不同而加以分離。色素水提取液中存在的脂溶性雜質，可用親脂性溶劑如石油醚、正已烷等將其除去。提取黃酮類色素時多采用乙酸乙酯-水兩相萃取，提取親水性強的苷類色素時則采用正丁醇-水兩相萃取。為了提高分離效果，也可采用逆流連續萃取和逆流分配方法。

3.1.8 酶法

酶是具有專一性的高效催化劑，其催化作用多在常溫、近中性的條件下進行，特別適合耐熱性不強的天然色素的精制。酶精制法主要是利用酶的專一催化分解作用除去雜質，如在粗提色素溶液中加入適量的果膠酶、蛋白酶、多酚氧化酶等，果膠和蛋白質類等物質能提高色素純度。雖然此法有其專一性等特點，但需要和其他方法聯用才能達到更好的分離和純化效果。據報道，在35℃、pH值4.7的條件下以多酚氧化酶處理花生衣，然后以酸堿處理制取色素，可獲得較好的純化效果。

3.1.9 醋酸鹽沉淀法

向色素溶液中加入質量分數5%的醋酸鉛，可使其中的色素沉淀，過濾收集沉淀，再用鹽酸酸化的乙醇溶解，可形成氯化鉛白色沉淀，過濾除去白色氧化鉛沉淀即可得到純度較高的花色苷溶液。

Apsalis等人曾以醋酸鉛沉淀法和離子交換樹脂法純化花色苷，獲得了純度較高的色素。由于醋酸鉛有劇毒，該法有醋酸鉛殘留的可能，因此該法不適用于食用天然色素的生產。

3.2 純化新技術應用案例

3.2.1 大孔徑樹脂層析分離技術

長春工業大學化學工程學院王道武采用AB-8大孔樹脂吸附紫薯色素，將吸附色素的大孔樹脂用一定量的95%乙醇解析。稱取20.0g干態AB-8大孔樹脂，用95%乙醇浸泡2h，裝入直徑1.5cm×30cm玻璃色譜柱，壓實。將裝好的柱子用2～3倍樹脂床體積的蒸餾水洗柱，待柱子穩定以后，將適量的花青素提取液以1.0mL/min上柱。用蒸餾水為流動相進行吸附，直至用Molish試劑檢測不含糖，再用95%的乙醇溶液，以1.0mL/min的流速進行洗脫，在波長280nm處檢測，收集出峰開始到出峰結束時的洗脫液，將洗脫液合并，經旋轉蒸發濃縮和烘箱干燥得到粉末樣品，收集后避光保存。

河北農業大學食品科技學院姚鈺蓉等也采用AB-8大孔樹脂對花青素粗提液進行純化。通過靜態吸附、解吸和動態吸附、解吸等試驗來考察AB-8大孔樹脂的純化性能。結果顯示：AB-8大孔樹脂對紫甘薯花青素具有較強的吸附能力，其飽和吸附量為0.06g/mL濕樹脂。pH值在1.0～3.0范圍內對樹脂吸附效果的影響差異不顯著。乙醇濃度對解吸效果有影響，70%的乙醇水溶液解吸效果最好。

3.2.2 膜分離技術

膜分離技術是利用膜孔徑大小特征在常溫下對溶質和溶劑進行分離達到純化目的，研究表明膜分離技術在中草藥分離純化中的應用主要有3大功能，即截留大分子雜質、濾除小分子物質和脫水濃縮。花青素的分子量449.2，而淀粉是紫薯提取中夾雜在花青素提取液中的大量雜質，淀粉的分子量在50000～500000之間，如果先選用截留分子量50000的微孔膜進行截留，然后再用10000的超濾膜進行分離，最后用反滲透或超濾膜進行濃縮，使水透過膜，這樣可獲得色價較高的花青素。尤其是花青素在高于60℃的條件下容易分解，采用相變的蒸汽加熱濃縮方法，色素損失相當大。因此，采用膜分離濃縮是最佳的選擇。

3.3 目前花青素類色素純化存在的主要問題

當前，由于花青素類色素受到了生產者和消費者的青睞，分離和純化研究備受關注。以上各種純化方法雖各具特色，但或多或少都存在著一些不足。下面就幾種主要分離純化方法存在的問題進行簡要說明。

3.3.1 大孔樹脂吸附層析的主要問題

從已有的資料來看，大孔樹脂純化色素時主要存在以下問題：

（1）樹脂的安全性，主要是指致孔劑和降解物帶來的安全性問題；

（2）反復使用時，吸附能力的降低；（3）樹脂使用過程中顆粒可能破碎；

（4）受其他物質的污染而降低分離能力。

3.3.2 凝膠層析的主要問題

凝膠層析的主要問題：

（1）反復使用時由于沉積作用而導致的流速變慢，生產效率降低；

（2）微生物污染問題，部分微生物可降解葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠，微生物滋生可降低凝膠的分離能力。

3.3.3 膜分離的主要問題

膜分離的主要問題：

（1）雜質污染可導致膜通過量快速下降，降低生產能力和效率；

（2）微生物污染帶來的衛生問題和大量清洗工作；

（3）二次污染問題；

（4）清洗劑的殘留問題；

（5）膜的溶解和破裂問題。

4 色素純化技術的發展趨勢

我國天然色素產業經過20多年的迅速發展，如今已經取得了令人矚目的成績，正朝著“天然、營養、多功能、高色價”方向發展，色素純化技術也正處于快速發展時期。從總體發展趨勢來看，大孔樹脂吸附層析法和膜分離法具有許多突出的優點，是未來的發展方向：

（1）分離過程是物理分離，被分離的組分沒有熱學性的變化，很少有化學性和生物性的變化，能較好地保持色素的穩定性和生理活性；

（2）濃縮時無需相變熱，能耗低；

（3）化學品消耗少，環境污染小；

（4）操作方便，易于工業化生產。

盡管大孔樹脂吸附層析法和膜分離法基本上還處于初級發展階段，實際應用還比較少，工業化生產尚需時日，但可以肯定這2種色素分離純化技術將是未來的發展方向，具有非常好的發展前景。

如何提高提取物的使用價值，與產品的純度有密切關系，但純化方法又關系到產品的成本，因此有必要對其純化方法進行必要的分析研究。