龍 逢 王筱靜 陳 星 陳 剛

精神分裂癥是一種重型精神疾病，以思維、情感、行為障礙與相互不協調為主要特征。在一般人群中終生患病率約為6.55‰［1］，至今病因未明。家系調查、雙生子及寄養子研究均顯示遺傳因素與發病密切相關［2～4］，遺傳方式復雜，顯性、隱性及多基因遺傳方式均有報道。迄今發現，許多基因與精神分裂癥相關聯，其中DISC1(精神分裂癥斷裂基因1)被列為重要的易感基因，我們的Affymetrix人類SNP6.0芯片對兩組精神分裂癥的全基因組關聯分析結果也均發現與此基因存在關聯(數據未發表)。本研究采用了高分辨率熔解曲線(HRM)分析的技術方法，對DISC1基因的全部外顯子區域在96例精神分裂癥患者和96例正常對照者進行了突變篩查，結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2004年8月在山東省濟南市精神衛生防治中心與濟南市歷城區錦繡川精神病療養院醫院住院的精神分裂癥患者(以下簡稱患者)96例;正常對照者96例(以下簡稱對照者)取自山東省血液中心獻血者。所有患者均符合國際疾病分類第十次修訂本(ICD-10)精神分裂癥診斷標準，其中男73例，女23例，年齡23～73 歲，平均年齡(40.80 ±9.49)歲，平均發病年齡(26.68±5.70)歲，患者間均無血緣關系。對照者中男63例，女33例，年齡18～53歲，平均年齡(23.09±3.01)歲。本研究得到了山東省醫學科學院基礎醫學研究所倫理委員會的批準，并獲得了患者與對照者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA制備 抽取患者與對照者的外周靜脈血5 ml，用EDTA做抗凝處理后－20℃冷凍保存。DNA采用廈門百維信生物科技有限公司 (Bio-V)的Lab-Aid 820自動核酸提取儀與500 μl全血磁珠提取核酸試劑提取。DNA濃度用美國賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific的NanoDrop 2000分光光度計檢測，每個樣本測定兩次，取其平均值。如果兩次誤差超過10%，則進行第3次測定后取兩個相近數值的平均值。最后將所有DNA樣品稀釋至終濃度1 ng/μl，用96深孔板(2 ml)－20℃凍存備用。

1.2.2 DNA模板分裝 用美國 APRICOT DESIGNs Personal Pipette PP-550N-XD移液工作站分裝5 μl(5 ng)至96孔PCR板(寧波)。

1.2.3 引物設計與合成 選用美國加州大學的基因組生物信息學網站UCSC Genome Bioinformatics(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)，輸入DISC1基因，在眾多轉錄本中選擇最長(外顯子最多)的一 個，在 HumanGeneDISC1(uc010pxh.2)Description and Page Index頁面，通過 Exon Primer(外顯子引物)，選擇Entire(全部)cDNA;引物序列提交上海博尚生物技術有限公司合成，見表1。

1.2.4 PCR 反應 基因組 DNA 5 μl(1 ng/μl)，10 ×EasyTaq buffer 2.0 μl(Trans Gen Biotech 全式金)，10 mM dNTPs 0.2 μl，5 μM Primer FR(左右)各 1.2 μl，5 μM SYTO9(飽 和 熒 光 染 料)1.5 μl，Easy Taq polymerase(Trans Gen Biotech 全式金)(5 U/μl)0.2 μl，加 ddH2O 9.1 μl使總反應體系為 20 μl。PCR 反應在美國 Applied Biosystem，ABI公司的 GeneAmp PCR System 9700擴增儀上進行，其反應條件如下:95℃預變性5 min;95℃變性30 s，56～59℃ 退火2 min，72℃延伸30 s，共50個循環;然后72℃保溫7 min，最后保存于25℃。

1.2.5 高分辨率熔解曲線分析基因掃描 (High Resolution Melting for Gene Scan) 對DISC1外顯子序列的突變檢測采用了美國公司的高分辨熔解曲線基因突變/基因分型檢測系統(Idaho Technology，Light Scanner HI 96)。高分辨熔解曲線分析采用LightScanner(HRM)高分辨率熔解曲線突變檢測/基因分型分析系統，溫度設置從65℃升至95℃。

1.2.6 統計分析 對最終得到的所有26對引物擴增后的PCR產物的基因掃描通過隨機所帶的Instrument＆Analysis軟件，Light Scanner wit Call-IT 2.0軟件完成。首先在 http://www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/POLAND/.silico得到經由電腦模擬的PCR產物的熔解曲線(見圖1)，將其與實驗中真實得到的PCR熔解曲線進行對比，通過對比吻合情況檢驗PCR擴增質量。熒光染料結合在DNA雙鏈，當溫度逐漸上升到一定程度，雙鏈的PCR產物就會解鏈，熒光染料會隨之開始逐漸脫落，完全解鏈后會全部脫落，這種變化會通過熒光曲線的下降直觀地反映出來。如果對照者與患者在這一段PCR產物的DNA序列完全一致，那么二者得到熔解曲線形狀就會完全吻合。有突變時解鏈的溫度會出現改變，表現為熔解曲線形狀改變。因此，通過與對照者熔解曲線作對比，會發現患者存在的突變。另外，患者與對照者的一般統計學數據通過Microsoft Office Excel XP軟件完成。

圖1 DISC1 Exon13.4理論模擬PCR產物熔解曲線

表1 精神分裂癥DISC1基因外顯子突變檢測引物序列

對DISC1基因全部13個外顯子的序列用26對引物經過PCR擴增后進行了高分辨率熔解曲線突變檢測，將96例患者與96例對照者的熔解曲線進行逐一對比，結果未發現突變，見圖2。

2 結果

圖2 DISC1 Exon13.496例對照者與96例患者的熔解曲線

3 討論

DISC1位于1號染色體的q42.2;全長約410 kb，包含13個外顯子，已發現有16個轉錄本。此基因編碼854個氨基酸的蛋白質，包括一個富含絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸的球狀N段區和一個由3～13號外顯子編碼形成的卷曲的C段區。羧基端區域富含許多環狀結構域，有利于 DISC1與其他蛋白間的結合［5，6］。

1990 年，St.Clair［7］對蘇格蘭某精神病高發家系的研究發現該家系中精神疾病患者的1q42存在易位突變。其平衡易位斷點部位位于染色體(1;11)(q42.1;q14.3)。2000 年，Millar等［8］發現了兩個直接被易位突變影響的基因，并命名為DISC1和DISC2。Millar認為這兩個基因是精神疾病的易感基因。

DISC1在成體和胚胎的許多組織中都有表達，在胎盤和腦中表達較高，在神經元的軸突末端、突觸后區域、線粒體、中心體、內質網及細胞核均有表達［9］。DISC1在腦組織中的發育是一個動態變化的過程，在人類發育的不同階段，各個部位表達的高低不同。這種表達模式表明DISC1基因在神經元發育和成熟過程中起到重要作用［10］。

DISC1與許多基因相互作用構成了精神疾病發病機制。2003年，Morris等［11］發現DISC1與多種中心體的和細胞骨架系統的蛋白如MIPT3，MAP1A，NUDEL，細胞膜上的受體蛋白如ACTN2，以及受體信號轉換蛋白如ATF4，ATF5相互作用。DISC1還參與了 LIS1/NUDE/NUDEL通路參與的微管活動，與微管蛋白和中心粒旁素也有結合，DISC1以及DISC1/NUDEL的結合參與了對神經突生長的調控。DISC1上有特殊的區域用于與以上蛋白的相互作用，敲除DISC1或突變的DISC1與以上蛋白的結合和相互作用發生改變，從而影響神經突的生長發育，以及影響細胞內物質轉運等生理活動。所以Morris等認為DISC1基因產物是多功能蛋白，DISC1基因的突變會破壞細胞間傳導、神經突構造和神經元遷移，從而導致精神分裂癥易感性升高。

2005年，Millar等［12］發現 DISC1與磷酸二酯酶-4B(PDE4B)的UCR2區的結合和相互作用與精神分裂癥的易感有關。這個結合是cAMP依賴性的，細胞cAMP水平升高可導致PDE4B與DISC1分離并恢復PDE4B的活性。DISC1可以通過與PDE4B的結合對其活性產生調控，這個過程可能與精神疾病的發病有關。

2009年，Mao等［13］研究發現 DISC1 通過調節GSK3-beta(糖原合成酶激酶3β)的活性和beta-catenin控制神經前體細胞增殖。DISC1直接作用于Gsk3β，并抑制重組體Gsk3β的活性，導致其磷酸化水平降低，β-catenin的穩定性升高。DISC1敲減的成年小鼠大腦齒狀回極度活躍并出現抑郁樣行為，但這些DISC1敲減引起的作用可被藥物抑制Gsk3β改變。

2003年，Hennah等［14］發現 DISC1基因上的一個重要區域HEP3。HEP3是一個跨越DISC1基因第一內含子到第二外顯子的單體型，包含 2個 SNP。Hennah等發現HEP3在芬蘭女性患者中不能有效的傳遞。HEP3單體型的傳輸失真具有性別差異，只在女性患者中不能有效傳遞。2004年，Hodgkinson等［15］通過對北美人群的病例對照研究證實HEP3單倍體的不充分表達與情感性精神分裂癥相關，同時從第1外顯子到第9外顯子的4個單倍型域中的多個單倍體型與精神分裂癥、情感性精神分裂癥、雙向情感障礙有關。他們還發現情感性精神分裂癥患者的DISC1基因上leu-607-pro有錯義突變過度表達現象。

基因的外顯子作為基因內的編碼序列，顯示轉錄成mRNA，然后在蛋白質生物合成過程中翻譯成蛋白質。因此，外顯子突變將影響基因的表達，并影響神經系統的發育和成熟，導致各種精神疾病的發生。對外顯子突變的檢測將有助于我們研究DISC1基因對精神疾病易感性的影響，并發現其影響精神疾病發病的病理生理機制。

高分辨率熔解曲線是由美國猶他大學保健科學中心病理學部Carl Wittwer實驗室與美國Idaho公司于2003年共同開發的一種建立在實時熒光定量PCR基礎上的技術，是通過飽和染料監控核酸的熔解曲線變化從而對DNA結構進行分析的一種技術。其原理是在DNA擴增的過程中加入飽和染料，并使飽和染料鑲嵌在擴增的DNA雙鏈之間。因此，一段雙鏈DNA分子在被加熱變性時，根據其GC含量和分布的差異，在不同的溫度解鏈，釋放出飽和染料，從而形成不同的熔解曲線。HRM檢測不受突變堿基位點和種類的局限，具有高靈敏度特異性、簡單方便、成本低、高通量等優點，可應用于基因分型和突變檢測等方面。本實驗使用HRM技術檢測了DISC1基因全部13個外顯子的突變情況，體會了檢測過程的快速、簡便、高通量，并且靈敏性和特異性較高［16～20］。

在此之前，Hennah［14］，Hodakinson［15］等均對DISC1基因進行過突變研究，然而卻只是針對某個或某些位點進行研究，本實驗對DISC1基因的全部13個外顯子進行設計合成了引物，對所有96個精神分裂癥樣本都進行了檢測，因此，是針對DISC1在精神分裂癥的一項系統而全面的實驗。其結果未發現突變的原因可能有以下兩點:(1)用于研究的患者樣本數量不夠大;(2)DISC1基因涉及精神分裂癥病因DNA變異存在于外顯子之外的其他DNA序列中，而外顯子中根本就不存在突變。

總之，本文系統全面地完成了對96例精神分裂癥患者的DISC1基因全部13個外顯子的突變檢測，未能發現突變，這對以后的研究有重要參考意義。同時也提示研究既要重視DISC1基因外顯子區域(如:進一步擴大研究樣本)，更要著眼于其外顯子之外的DNA區域(如:基因調控區，剪切與內含子區域等)。

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