上海市某結核病定點醫院結核病房空氣樣本中分枝桿菌的檢測

江淵 劉輊彬 桂曉虹 沈鑫 張忠順 肖和平 梅建

肺結核是嚴重危害公眾健康的呼吸系統傳染病之一，結核病定點醫院是結核病患者集中診斷、治療和康復的場所，其空氣質量關系著患者及醫務人員的身心健康［1］。為了解痰涂片抗酸桿菌陽性患者病房空氣中是否存在結核分枝桿菌，筆者對上海市某結核病患者定點收治醫院結核病房中的空氣樣本進行了分枝桿菌的檢測和鑒定，為預防醫院內感染、控制和管理提供客觀的事實依據，以減少醫院感染的發生。

材料和方法

一、材料和試劑

1．空氣樣本來源：采集2009年6—10月間上海市某結核病患者定點收治醫院22間結核病房中空氣樣本134份，均在痰涂片抗酸桿菌陽性（＋～＋＋＋＋）患者床邊采集。每間病房均有4張床位，每間病房的空間布局相同但患者組成情況不完全相同。床邊采樣患者入院時的臨床診斷均為痰菌陽性的肺結核，入院后根據痰培養及菌種鑒定結果診斷為：肺結核或者非結核分枝桿菌病。這22間病房同期收住的其他患者分別為肺結核（50%左右）、結核性胸膜炎（20%左右）、肺癌（10%左右）、肺炎（10%左右），其余為非結核分枝桿菌病、陳舊性肺結核和結核性腦膜炎患者。診斷依據參照中華醫學會《臨床診療指南：結核病分冊》［2］及其他呼吸系統疾病的臨床診療指南（中華醫學會叢書）。采樣時間為患者入院當天或第二天（患者入院后24h內），在醫院對患者進行抗結核治療前進行采樣，采樣時門窗關閉。

2．主要儀器和試劑：液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器（FA－1型撞擊式空氣微生物采樣器）為遼陽市康潔儀器研究所產品，BacT／ALERT 3D全自動快速培養儀及液體培養基為法國生物梅里埃（中國）股份有限公司產品，3130基因分析儀及相應試劑為美國應用生物系統（Applied Biosystems）公司產品，抗酸染色液為珠海貝索生物技術有限公司產品，羅氏培養基由上海市疾病預防控制中心培養基室提供，氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等為中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司產品（分析純）。

二、方法

（一）空氣樣本的采集方法

采用液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器（FA－1型撞擊式空氣微生物采樣器），在采樣瓶中加入無菌生理鹽水10ml作為采樣介質，進行空氣采樣。采樣時，采樣器進氣口放置距離地面1．2m處，同時將進氣口對著采樣患者（距離小于1m），流量控制在9L／min左右，采樣時間為30min，每位患者床邊采樣1份。每份空氣樣本采集后，在生物安全柜中將10ml采樣液收集至無菌50ml離心管中，送至我實驗室進行分枝桿菌分離培養。

（二）空氣樣本前處理

每份空氣樣本中加入等量氫氧化鈉－N－乙酰－L－半胱氨 酸 （N－acetyl－L－cysteine－sodium hydroxide，NALC－NaOH）前處理液［3］消化15～20min后，再加入PBS緩沖液（pH值為6．8）至終體積45ml，4℃條件下3000×g離心15min，棄上清。沉淀加入0．7ml PBS緩沖液（pH 值為6．8），吹打混勻后，用于后續分離培養試驗。

（三）樣本中分枝桿菌分離培養

經過前處理的樣本接種于BacT／ALERT 3D液體培養管和中性羅氏培養基，分別置于BacT／ALERT 3D全自動快速培養儀和37℃培養箱中培養。BacT／ALERT 3D快速液體培養按照法國生物梅里埃（中國）股份有限公司提供的“BacT／ALERT 3D系統操作手冊”（Version B．01版）進行，樣本接種羅氏培養基按《結核病診斷細菌學檢驗規程》進行［3］。

（四）培養陽性樣本的確認及菌型鑒定

1．陽性培養物涂片抗酸染色確認：BacT／ALERT 3D液體培養和羅氏培養陽性后需經涂片抗酸染色確認為抗酸桿菌?？顾崛旧R檢及其結果的判定按《結核病診斷細菌學檢驗規程》進行［3］。

2．培養陽性的分枝桿菌經DNA序列分析進行菌型鑒定：DNA模板的制備按照煮沸裂解法進行提取。從羅氏培養基上刮取1～2接種環陽性培養物，重懸于200μl TE溶液中，80℃滅活30min（BacT／ALERT 3D培養陽性樣本，轉種至中性羅氏培養基，待菌落生長至對數生長期后進行上述操作）。滅活后的菌株DNA 100℃水浴10min煮沸裂解，立即置冰上2min，13 000×g離心15min后，取上清置于另一無菌1．5ml EP（eppendorf tubes）管中，－20℃保存備用。

根據16SrRNA編碼基因保守區設計通用引物：P1：5′－TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；P2：5′－ACCGCGGCTGCTGGCAC－3′。PCR 擴 增模板DNA，反應條件為：94℃預變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，經過35個循環，最后72℃延伸5min。然后對PCR產物進行DNA測序分析（實驗室自測，PCR產物同時送上海桑尼生物科技有限公司測序，復核測序結果），測序完成后，利用序列分析軟件Sequencing Analysis 5．3，得到電泳圖譜及基因序列。最后將16SrRNA結果與GenBank上標準序列包括結核分枝桿菌標準序列M．tuberculosis（ATCC 27294）、胞內分枝桿菌標準序列M．intracellulare（DSM 43223）、戈登分枝桿菌標準序列M．gordonae（Borste 9411／99）比對，分析鑒定該菌種。

（五）統計學方法

使用SPSS 15．0軟件對檢測數據進行分析：以傳統的羅氏培養方法培養結果為金標準，BacT／ALERT 3D液體培養方法與羅氏培養方法對醫院空氣樣本中分枝桿菌分離率的比較采用配對卡方檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

（六）質量控制

每批試驗均設立陽性對照和陰性對照，結核分枝桿菌標準菌株H37Rv（ATCC 27294）作為陽性對照質控菌株，以滅菌PBS緩沖液（pH值為6．8）為陰性對照。在兩種分離培養方法操作規程規定的報告時間內，接種H37Rv的培養基中應有結核分枝桿菌生長，接種滅菌PBS緩沖液的培養基中不應有細菌生長。

結 果

1．分枝桿菌分離培養：在結核病房痰涂片抗酸桿菌陽性患者床邊采集到的134份空氣樣本中，有3份樣本分枝桿菌分離培養陽性。

134份空氣樣本經BacT／ALERT 3D液體培養方法培養陽性3份，陽性檢出率為2．3%（3／132），污染2份，污染率為1．5%；經羅氏培養方法培養陽性2份，陽性檢出率為1．5%（2／133），污染1份，污染率為0．7%；兩種培養方法共同培養陽性2份。經配對卡方檢驗，兩種培養方法對醫院空氣樣本中分枝桿菌分離率差異無統計學意義（P＞0．05），詳見表1。

表1 BacT／ALERT 3D液體培養法與羅氏培養法對醫院空氣樣本中分枝桿菌檢出情況（份）

2．分枝桿菌菌型鑒定：3份培養陽性樣本，分別進行涂片抗酸染色確認為抗酸分枝桿菌后，進行菌型鑒定。經DNA序列分析比對，分別為結核分枝桿菌、胞內分枝桿菌和戈登分枝桿菌。

圖1 分枝桿菌16SrRNA基因PCR擴增結果

3．培養陽性的3份樣本其來源病房的患者情況：具體見表2。其中戈登分枝桿菌陽性標本患者入院時已于外院抗結核治療2個月，外院痰涂片＋。而胞內分枝桿菌來源患者入院時已于外院抗結核治療1年余，外院痰涂片＋。結核分枝桿菌陽性標本來源患者入院時已于外院抗結核治療2個月，外院痰涂片＋。

討 論

在結核病定點收治醫院的特定環境中，空氣中分枝桿菌的污染可能是導致結核病院內感染的重要媒介［4－5］。肺結核通過空氣中的帶菌氣溶膠傳播，結核分枝桿菌氣溶膠主要來自患者咳嗽、打噴嚏等直接噴出的帶菌飛沫，其次由落在物體表面的結核分枝桿菌隨塵土漂浮到空氣中形成的再生菌塵氣溶膠［6］。

1．對134份采自結核病房痰涂片抗酸桿菌陽性住院患者床邊空氣樣本分離培養結果的分析：本研究中，檢測的134份空氣樣本分別采自不同結核病房痰涂片抗酸桿菌陽性（＋～＋＋＋＋）患者病床邊。其中有3份空氣樣本分枝桿菌培養陽性，結合DNA測序結果分析，分別為：結核分枝桿菌、致病性的胞內分枝桿菌、戈登分枝桿菌。1例胞內分枝桿菌來自于痰菌陽性的非結核分枝桿菌肺病患者的床邊采集樣本，同病房其他3位患者的臨床診斷分別為：結核性腦膜炎、陳舊性肺結核；結核性腦膜炎、血行播散性肺結核；左肺鱗癌。這3位患者痰樣本中均未分離培養出分枝桿菌。但是醫院對該采樣病床患者的痰標本臨床分離菌株僅鑒定到非結核分枝桿菌，筆者沒有獲得該患者的臨床菌株，無法進一步鑒定是否為胞內分枝桿菌，亦無法進行菌株基因型的比對分析，對于空氣中分離到的菌株是否為該患者呼吸道排出缺乏實驗室數據的支持。1例結核分枝桿菌來自于菌陽肺結核患者的床邊采集樣本，同病房其他3位患者均為菌陽肺結核患者。但是由于沒有獲得這4位患者的痰標本臨床分離菌株，未進行菌株基因型的比較分析，因此無法判斷空氣中分離到的菌株與患者感染的菌株是否存在同源性。另外1例空氣樣本中分離培養出戈登分枝桿菌，采樣病床患者在該醫院入院后檢查痰菌陰性，同病房其他3位患者中2位為痰菌陽性的肺結核患者，1位為痰菌陰性的肺結核患者。由于自然界中本身就存在戈登分枝桿菌，結合空氣樣本采集時病房收住患者情況分析，病房收住的患者中沒有感染戈登分枝桿菌的非結核分枝桿菌病患者，該例戈登分枝桿菌可能是由住院患者及其家屬從環境中帶入病房。另外，在課題最初設計的時候，課題研究目的僅想了解收住菌陽肺結核患者的結核病房空氣中是否存在分枝桿菌，及收住菌陽肺結核患者的結核病房空氣中是否有傳播結核病的風險，所以各病房患者病情輕重及各病房收住患者情況并不完全相同，患者的病情輕重不完全相同，所以沒法判斷這些因素對病房空氣中菌含量是否有影響。

表2 培養陽性的3份樣本其來源病房的患者情況

2．空氣樣本中分枝桿菌分離培養方法的選擇：在空氣樣本中分枝桿菌的分離培養方法上，本研究采用了世界衛生組織推薦的NALC／NaOH消化法消化－去污染后分別接種至中性羅氏培養基和BacT／ALERT 3D快速液體培養基進行分枝桿菌的分離培養。134份空氣樣本經BacT／ALERT 3D液體培養方法培養陽性3例，經羅氏培養方法培養陽性2例，2種培養方法共同培養陽性2例，2種培養方法對醫院空氣樣本中分枝桿菌分離率經配對卡方檢驗（P＞0．05），差異無統計學意義。但BacT／ALERT 3D液體培養試驗成本較高，不適宜作為空氣樣本常規檢測的首選方法，因此建議使用分枝桿菌羅氏培養作為醫院空氣定期監測的常規方法，但是標本在首次分離時建議BacT／ALERT 3D液體培養與傳統羅氏培養法聯合使用，以提高檢出率，保證空氣監測效果。

3．對于預防院內感染的一些建議：衛生保健工作人員 （HCW）醫院內結核感染問題不容忽視。Menzies等［7］采用文獻調研的方法，對部分中低收入國家的HCW結核感染情況進行了調查，結果顯示中低收入國家中HCW的結核發病率遠高于一般人群。近年來，非結核分枝桿菌引起院內感染的問題也越來越受到專家的重視。本研究結果顯示，該結核病患者定點收治醫院在結核病房涂陽患者床邊采集的空氣樣本中可分離培養出結核分枝桿菌，以及其他致病性非結核分枝桿菌。雖然目前無法判斷這些菌株是否由于當時住院患者傳播所致，但是這一結果提示：（1）加強環境管理，結核病房定期開窗通風和進行紫外線消毒，從而切斷結核分枝桿菌的繼續傳播途徑；（2）對醫院空氣進行定期檢測，及時掌握空氣質量；（3）加強院內健康教育，提高醫護人員、患者及其家屬的自我防護意識；（4）加強醫護人員、患者及其家屬的個人防護措施；以切實保護醫護人員、患者及其家屬的身體健康，控制院內感染。同時本研究結果也提示，不但菌陽結核病患者房間有病原體存在和傳播的風險，非結核分枝桿菌痰菌陽性的患者房間也有病原體存在和傳播的風險，同樣需要引起防控機構的重視。

綜上所述，該醫院結核病房痰涂片抗酸桿菌陽性患者床邊所采集的空氣樣本中可分離到分枝桿菌，雖然目前尚無法判斷這些菌株是否由于就診患者傳播所致，但是這一研究結果提示：定期監測醫院內空氣質量是防控醫院內感染的一項重要措施。同時，本研究結果也提示：不但菌陽結核病患者的房間有病原體存在和傳播的風險，非結核分枝桿菌痰菌陽性的患者房間也有病原體存在和傳播的風險，同樣需要引起防控機構的重視。由于本研究沒有獲得空氣樣本采集時病房中收住患者的痰標本臨床分離菌株，因此無法確定空氣中檢測到的分枝桿菌是來源于被檢患者、同病房其他患者還是到該醫院就診的其他患者，甚至是否來源于外環境。本研究也為今后結核病醫院內空氣質量監測提供了一個借鑒：在進行結核病房空氣監測時，同時期病房收住患者的治療情況、采樣時是否排菌，以及臨床分離菌株的收集與保存也不容忽視，將空氣中分離得到的菌株基因型與患者的痰標本臨床分離菌株基因型進行比較分析，能夠更嚴謹地為病房空氣中分離到病原體的來源提供科學依據。

［1］王芳，易濱，劉軍，等．結核分枝桿菌醫院感染現狀及預防控制措施研究．中華醫院感染學雜志，2009，19（21）：2927－2929．

［2］中華醫學會．臨床診療指南：結核病分冊．北京：人民衛生出版社，2005．

［3］中國防癆協會基礎專業委員會．結核病診斷細菌學檢驗規程．北京：中國教育文化出版社，2006：13－45．

［4］邢玉斌，魏華，索繼江，等．空氣消毒器現場消毒效果評估．中華醫院感染學雜志，2006，16（7）：774－775．

［5］武迎宏，鄧明卓，申玉玲，等．人員流動狀態下空氣消毒效果的觀察．中華醫院感染學雜志，2007，17（7）：828－830．

［6］張本，王忠仁，童小玫，等．結核病房空氣中結核分支桿菌檢測方法研究．中華結核和呼吸雜志，1997，20（2）：101－103．

［7］Menzies D，Joshi R，Pai M．Risk of tuberculosis infection and disease associated with work in health care settings．Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（6）：593－605．