阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶的原核表達及其多克隆抗體制備

徐曉可，吳清平，張淑紅，張菊梅，李程思，郭偉鵬

（廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物應用新技術公共實驗室，廣東省華南應用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，廣東省微生物研究所，廣東廣州510070）

阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）是奶制品中備受關注的一種致病菌[1-3]，FAO/WHO將阪崎腸桿菌列為嬰兒配方奶粉中的A類致病菌。由于阪崎腸桿菌在奶粉中的污染水平很低，而且奶粉不是無菌產品，可能會存在各種雜菌的污染，因此在檢測阪崎腸桿菌時會有其他菌的干擾或者競爭，免疫磁珠分離技術會在一定程度上解決這個問題。免疫磁珠能特異性吸附目的細菌，可有效地富集大量樣品中的少量病原菌，為解決環境及食品中細菌富集問題提供了一種有效手段，在食品微生物檢測領域得到了廣泛的應用[4-6]。免疫磁珠分離方法的特異性與所用的抗體密切相關，抗體制備是免疫磁珠的基礎。本研究的目的是克隆和原核表達阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因malA，獲得阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶融合蛋白，制備特異性好的兔抗α－葡萄糖苷酶的多克隆抗體以用于研制免疫磁珠。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阪崎腸桿菌ATCC 29544、大腸桿菌DH5α、表達質粒pET22b（+）由本實驗室保存；pMD 19－T Simple Vector 購自TaKaRa公司；大腸桿菌BL21（DE3）購自TIANGEN公司；限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA連接酶 購自TaKaRa公司；DNA聚合酶（Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2×））、DNA marker、蛋白marker 購自Fermentas公司；PCR產物回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒、質粒小量抽提試劑盒 購自上海生工生物工程有限公司；弗氏佐劑和弗氏不完全佐劑 購自Sigma公司；其他試劑 國產分析純；實驗用的各種培養基 均購自廣東環凱微生物科技有限公司；新西蘭大白兔 購自中山醫科大學試驗動物中心。

PCR儀 美國BIO－RAD公司；凝膠分析成像系統 美國GE公司；微量離心機 德國Ependorf公司；熒光顯微鏡 德國LEICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與合成 參考Genebank公布的序列，設計正反向引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為

ESF：5’－TTTGGATCCGATGAGTGAAGCACCGA CGCAG－3’；

ESR：5’－GGCGAAGCTTCGACGTCAGTTTATAA ACCCG－3’。引物ESF和ESR下劃線序列分別表示BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。

1.2.2 malA基因的PCR擴增及克隆 以阪崎腸桿菌ATCC29544基因組DNA為模板進行PCR擴增，體系為50μL，Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）25μL，引物ESF和ESR各2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL。PCR反應條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃1min，35個循環；72℃ 7min。回收PCR產物，與pMD19－T Simple Vector連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，利用上海生工生物工程有限公司的UNIQ－10柱式質粒小量抽提試劑盒抽提質粒，進行BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定及測序鑒定。

1.2.3 表達載體的構建 將上述鑒定正確的重組質粒和pET22b（+）質粒載體用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切，將純化的DNA片段與線性化的pET22b（+）載體連接，熱激轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞。提取質粒、PCR及酶切鑒定。

1.2.4 蛋白的誘導表達及純化 挑選陽性菌株和對照菌株的單菌落，接種于5mL含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基，37℃ 200r/min培養至OD600為0.6時，分別加入終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的IPTG誘導3、4、5h，將誘導產物進行SDS－PAGE檢測，確定最佳IPTG誘導濃度和誘導時間。

按上述所確定的最佳參數誘導表達重組蛋白，將收集到的誘導菌液超聲至澄清透亮，收集包涵體；用6mol/L的尿素洗滌包涵體進行SDS－PAGE蛋白分離；膠上割取目的帶，加入適量的PBS溶液進行搗碎，置4℃緩慢攪拌過夜；離心12000r/min 5min，收集上清液，并裝入透析袋，用PEG－20000濃縮，置－80℃冰箱保存。

1.2.5 多克隆抗體制備及鑒定 新西蘭大白兔（雌雄各一只，13周兔齡，體重為2.4kg）適應性飼養1周后，初免取1mg/只純化蛋白用Sigma完全佐劑充分乳化，背部皮下多點注射；初免2周后加強免疫4次，每次間隔1周，前3次免疫劑量為0.5mg/只，蛋白用Sigma不完全佐劑乳化，背部皮下多點注射；末次加強免疫劑量為2mg/只，耳緣靜脈注射，3d后取血。在免疫前采5mL陰性血液，用于陰性血清檢測用。間接ELISA方法測定抗血清效價。

免疫熒光法鑒定與阪崎腸桿菌表面結合能力：首先，將一定濃度阪崎腸桿菌菌液100μL滴加至載玻片上，在超凈臺中自然風干，然后滴加抗血清100μL，37℃孵育lh；用PBST洗滌載玻片3次，用FITC標記的羊抗兔IgG（1∶100）37℃孵育lh；PBST洗滌4次，然后在熒光顯微鏡下觀察阪崎腸桿菌菌體的發光情況。

2 結果與分析

2.1 malA基因的克隆及鑒定

圖1 malA基因的PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product

圖2 pMD19－malA的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid pMD19－malA

圖3 pMD19－malA的酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pMD19－malA

利用設計的引物擴增出約1600bp左右的目的基因片段，與malA基因預期大小相符（圖1）。重組質粒經PCR鑒定可以擴增出1600bp左右片段（圖2），證實malA基因已成功克隆到T載體。用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切亦獲得1600bp左右的片段（圖3）。經測序鑒定，malA基因全長1677bp，其序列與Genebank的序列具有100%的同源性。

2.2 malA基因表達質粒的構建及鑒定

重組表達質粒pET22b－malA雙酶切的電泳結果如圖4所示，在約1600bp處出現目的條帶（與預期相符），說明目的基因成功插入表達載體pET22b中。

圖4 pET22b－malA的酶切鑒定Fig.4 Identification of recombinant plasmid pET22b－malA

2.3 蛋白誘導表達及純化

SDS－PAGE結果（圖5）表明，其最優化的表達條件是37℃下用0.8mmol/L IPTG誘導5h。重組蛋白以包涵體形式存在（圖6）。切膠純化的目的蛋白分子量約為67ku（圖7）。

圖5 SDS－PAGE分析不同IPTG濃度和不同誘導時間對蛋白表達的影響Fig.5 SDS－PAGE analysis of protein expression with different IPTG concentration and different induction time

圖6 融合蛋白的可溶性分析Fig.6 Soluble analysis of fusion protein

圖7 融合蛋白切膠純化電泳圖Fig.7 SDS－PAGE analysis of fusion

2.4 多克隆抗體效價

用間接ELISA檢測其效價約為5×105（圖8）。

圖8 多克隆抗體效價曲線Fig.8 Titer cure of polyclonal antibody

2.5 多克隆抗體與阪崎腸桿菌菌體的結合

熒光顯微鏡觀察的結果顯示多抗能與阪崎腸桿菌菌體有較好的特異性結合（圖9）。

圖9 多抗與阪崎腸桿菌菌體結合Fig.9 Combination of the polyclonal antibody and E.sakazakii

3 討論

由于阪崎腸桿菌是條件致病菌，只是對免疫力低下的人群造成危害，雖有報道對成年人也有影響，但危害較小，所以一直以來并未對食品中阪崎腸桿菌進行檢測控制。但是自從阪崎腸桿菌造成的危害頻頻報道后，食品中特別是嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的檢測就顯得非常重要[7]。目前國內外已建立了多個檢測標準，包括國際標準化組織ISO標準、美國FDA標準、中國國家標準GB和行業SN標準，這些標準主要還是沿用傳統的檢測方法，檢測周期比較長。近年來國內外還發展了針對阪崎腸桿菌的分子生物學檢測方法[8－12]。上述方法都涉及樣品前處理，其中免疫磁珠分離技術是樣品前處理的有效手段，但目前市場上沒有針對阪崎腸桿菌的多克隆抗體和單克隆抗體，所以制備抗體對免疫磁珠方法的建立十分必要。

阪崎腸桿菌的α-葡萄糖苷酶活性是區別于腸桿菌科其他細菌的一個重要特征，在文獻報道的所有樣品分離株中均呈現為陽性，α-葡萄糖苷酶活性能夠分解p-nitrophenyl-alpha-D-glucoside底物，呈現藍綠色[13]，這也是采用傳統生化培養法檢測阪崎腸桿菌的關鍵性步驟。根據Genebank該基因的序列分析可知，其表達產物為跨膜蛋白，這與楊捷琳等[14]的實驗結果一致。因此，它可以做為檢測阪崎腸桿菌的一個很好的靶點。在抗原設計上采用α-葡萄糖苷酶基因malA的全長，插入到pET-22b（+）原核表達載體中。由于該載體為高表達載體，融合蛋白的表達量很高，表達的蛋白質以不溶性包涵體形式存在。因此，本研究采用包涵體作為抗原，利用割膠回收的融合蛋白制備多克隆抗體，結果證明這種方法在制備多克隆抗體時是可行的，且方法操作簡便。為探討該多抗能與阪崎腸桿菌表面結合，在多抗與阪崎腸桿菌孵育1h后，使用FITC標記的羊抗兔二抗處理，然后在熒光顯微鏡下觀察阪崎腸桿菌菌體的發光情況。結果顯示，多克隆抗體能與阪崎腸桿菌表面結合。多克隆抗體的制備成功為進一步研制免疫磁珠提供了重要工具，為快速靈敏檢測阪崎腸桿菌奠定基礎。

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