流式細胞術在實驗教學中的開發與應用

張 英， 黎宏宇， 李 莉， 楊 舉， 成 軍， 郝林琳， 于 浩

(吉林大學畜牧獸醫學院，吉林長春130062)

0 引言

流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是20世紀70年代發展起來的利用流式細胞儀(Flow Cytometer)快速定量分析細胞群的物理、化學特征以及利用這些特征精確分選細胞的新型技術，主要包括流式分析、流式分選兩部分。流式細胞儀的出現及流式細胞術的發展是多學科領域高度發展的結晶，其中涉及到細胞生物學、分子生物學、生物技術、分子免疫學、單克隆抗體技術、電子物理技術、納米技術、激光技術、流體力學、熒光化學、光電測量技術、計算機技術等多個領域［1-2］。

FCM既可以測量細胞大小、細胞內顆粒的復雜程度、細胞表面積、核漿比例、DNA含量、RNA及蛋白質含量，也可以檢測細胞表面/胞漿的特異性抗原、細胞活性、細胞因子、細胞受體、激素結合位點等，該技術作為一種快速細胞分析技術，不僅應用于免疫學、細胞生物學、微生物學、發育生物學、生理學等基礎醫學研究，更廣泛應用于臨床的各個方面，如腫瘤學、血液學(血常規檢查)、藥物學、臨床檢驗等各方面［3-5］。

因此，2009年吉林大學農學部利用985項目建設平臺，引進一臺美國BD公司，型號為AriaⅡ的流式細胞儀，并在動物醫學、動物生物技術專業的細胞生物學實驗教學中率先引入了流式細胞技術，旨在實現細胞生物學、FCM理論知識教學與學生動手操作能力培養的有效融合。

1 流式細胞術原理

流式細胞儀主要由流動室及液流驅動系統，激光光源及光束形成系統，信號檢測、存貯、光電轉換、數據處理系統和細胞分選系統5部分組成。

將待測標本制成單細胞懸液，經不同的熒光染料染色后加入流式上樣管，由氣壓裝置送入流動室，樣品在鞘液的的包被下成單行排列，以一定流速經過噴嘴進入激光聚焦區，在激光束的照射下，產生散射光信號和熒光信號。散射光信號包括前向角散射光(Forward Scatter，FSC)及側向角散射光(Side Scatter，SSC)。FSC主要反映細胞的大小，SSC主要反映細胞質、胞膜、核膜的折射情況以及細胞內顆粒的復雜程度。熒光信號的強弱反映了所測細胞表面抗原的強度或細胞內物質的濃度。光信號通過波長選擇通透性濾片后，經PMT接收轉化為電信號，再經模/數轉換器，轉換為可被計算機識別的數字信號，計算機對采集的各種信號用相應的應用軟件進行分析處理，以一維直方圖、二維、三維散點圖或等高線圖以及數據表等形式顯示出來［6-8］。

2 實驗設計部分

2．1 儀器演示

鑒于AriaⅡ型流式細胞儀既可用于流式分析又可用于細胞的無菌分選，對存放環境要求較高，目前置于吉林大學畜牧獸醫學院生物技術綜合實驗室(見圖1)。選修細胞生物學實驗課的本科生及研究生人數較多，我們采取儀器現場觀摩、學生分組輪換形式對儀器進行講解。

圖1 AriaⅡ流式細胞儀

學生應更換工作服、拖鞋后方可進人流式細胞儀實驗室。教師先講解流式細胞儀的組成由液流系統、光學系統、電子控制系統、數據處理系統及細胞分選系統5個部分，并分別介紹每一部分的具體構造及在整個系統中所起的作用，待分析的標本在儀器中經過的“路徑”，將流式細胞儀原理介紹貫穿入各個系統中，使學生對流式細胞儀有個整體的感官認識。逐一開啟穩壓電源、計算機、激光電源進入開機程序，強調開機過程中的應注意那些問題。運行 BD FACSDiva Software軟件并進入軟件界面，此部分做重點講解:軟件的組成部分及每一部分的具體作用;流式細胞術的常用術語介紹:FSC、SSC、流式通道、門、A、H、W、CV等;流式結果的表示形式:單參數直方圖、雙參數點圖或等高線圖、疊加圖，FSC-SSC為物理參數圖，采用散點圖表示，細胞染一種熒光，一般用直方圖表示，雙色或多色，常用散點圖或等高線圖表示，當然也可以把散射光參數與熒光參數隨意組合，并可根據需要進行相互轉換［9］;以單色和雙色實驗為例，利用BD公司培訓用的熒光微球，現場演示單色和雙色實驗標本的分析方法，包括文件的建立、標本的準備、參數的設定、樣品的采集、結果分析、數據的導入導出等;最后進行儀器關機及日常維護的講解。通過上述學習，學生對流式細胞術的理論知識、儀器的原理及構造有了更為深刻、系統的認識，為后續實驗的完成奠定了基礎。

2．2 實驗內容

2．2．1 儀器、材料與試劑

流式細胞儀，生物安全柜，CO2培養箱，低溫高速離心機，移液器(1mL、200 μL)，槍頭(1 mL、200 μL)，DMEM(Hyclone);pCI-EGFP質粒(實驗室構建)，293T細胞，lipofectin2000(Invitrogen)，Balb/C 小鼠，FITCAnti-Mouse CD4(Biolegend)，PE-Anti-Mouse CD8a(Biolegend)，CY5/PE-Anti-Mouse CD3e(Biolegend)。

2．2．2 方法

實驗一:pCI-EGFP質粒轉染293T細胞后EGFP蛋白的表達。

(轉染方法按lipofectin2000(Invitrogen)進行。)

(1)轉染前1天將293 T細胞用無抗生素培養液接種到6孔板中，當細胞達到70% ～80%融合時即可進行細胞轉染。

(2)轉染液的準備。A液:用無血清培養液稀釋3μg質粒至15μL，B液:用無血清培養液稀釋10μL脂質體至15μL。輕輕混合兩種液體，室溫放置20 min。

(3)轉染準備。細胞用1．5 mL無血清培養液漂洗2次，再加入2 mL無血清培養液。

(4)轉染。將A/B混合液緩慢加到6孔板中，搖勻，37℃培養4 h后，更換10%DMEM培養液中繼續培養。

(5)轉染24 h后，將細胞用胰酶消化，分散后用PBS漂洗2次，并重懸于PBS中，密度為(5～10)×106cells/mL。

(6)流式細胞儀檢測。陰性對照為未轉染質粒的293 T細胞。

實驗二:小鼠脾臟T淋巴細胞亞類的檢測

(1)將制備好的脾臟T淋巴細胞懸液取2×106個淋巴細胞于EP管中。

(2)加入1mL的熒光洗液，1 500 r/min離心10 min，洗滌2次。

(3)每管加入FITC-Anti-Mouse CD4單克隆抗體(0．5 mg/mL)、PE-Anti-Mouse CD8a 單克隆抗體(0．2 mg/mL)、CY5/PE-Anti-Mouse CD3e(0．2 mg/mL)的熒光洗液200μL重新懸浮細胞，混勻后4℃避光孵育30 min。

(4)加入1 mL熒光洗液，1 500 r/min離心10 min，洗滌2次。最后用500μL熒光保存液重懸。

(5)流式細胞儀檢測。相同方法，同時分別制備各染色抗體單染對照管和空白管。

2．2．3 結果與分析

實驗一:pCI-EGFP質粒轉染293T細胞后EGFP蛋白的表達。

GFP(綠色熒光蛋白)是來自海洋生物水母的一種天然熒光蛋白，它在細菌、真菌、動物和植物細胞中表達時都能夠發出熒光，這使它成為一種理想的熒光標記蛋白。增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因是在水母來源的野生型GFP基因的基礎上，替換了影響熒光表達效率的88個密碼子中的92個堿基所構建的合成基因，可以顯著提高其在動物細胞中的熒光效能，大大增強了該報告分子的靈敏度，其激發光波長為488 nm，發射光波長為507 nm，同時由于Em值的顯著提高等諸多特性使EGFP非常適用于流式細胞術(FCM)分析［10-11］。因此突變型EGFP基因比野生型更適用于作為報告基因和篩選標記，目前廣泛應用于細胞生物學、分子生物學和發育生物學等領域［12］。

圖2為FSC-SSC物理參數圖，確定待檢測的細胞群;圖3為EGFP單參數直方圖(峰圖)，“P2”門為表達EGFP的陽性細胞情況。

圖2 FSC－SSC物理參數圖

圖3 EGFP單參數直方圖

實驗二:小鼠脾臟T淋巴細胞亞類的檢測。

淋巴細胞是正常機體免疫系統功能最重要的一類細胞群。在免疫應答過程中，脾臟淋巴細胞發育成為功能不同的亞類，各亞類的數量和功能發生變化時，表明機體的免疫狀態發生變化［13］。流式細胞儀可同時檢測一種或幾種淋巴細胞細胞表面抗原，通過不同的淋巴細胞亞類數量的測定來確定機體的免疫狀態［14-15］。

圖4為FSC-SSC物理參數圖，確定待檢測的淋巴細胞群;圖5為CD3+/CD4+雙參數散點圖;圖6為CD3+/CD8+雙參數散點圖。Q1:CD4單陽性細胞;Q2:CD3+/CD4+雙陽性細胞;Q3:CD3-/CD4-雙陰性細胞;Q4:CD3+單陽性細胞;Q1-1:CD8單陽性細胞;Q2-1:CD3+/CD8+雙陽性細胞;Q3-1:CD3-/CD8-雙陰性細胞;Q4-1:CD3+單陽性細胞。

圖4 FSC－SSC物理參數圖

圖5 CD3+/CD4+雙參數散點圖

圖6 CD3+/CD8+雙參數散點圖

3 結語

該實驗教學實現了教學和科研的有機結合，既重溫了細胞培養技術，又加深了對FCM基礎知識的理解和掌握。從細胞標本的制備到上機檢測、結果分析等一系列步驟中，既培養了學生動手操作能力、科研分析及解決問題的能力，也充分調動了學生的積極性，增加了師生之間的互動，優化了教學過程，提高了教學質量，取得了滿意的教學效果。在提高流式細胞儀利用率的同時，也最大程度地發揮了現有儀器設備的資源優勢和師資特長，使學生接受了最好的專業訓練。

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