以活性為指導分離珊瑚蘚凈抗菌有效成分及作用機理初步研究

李思明，沙長青，楊 非

(1.黑龍江省科學院微生物研究所應用醫學微生物室，哈爾濱 150010;2.黑龍江省科學院，哈爾濱 150001;3.哈爾濱市中心醫院檢驗科，哈爾濱 150087)

真菌是醫院內感染常見微生物，由真菌引起的感染臨床診斷率較低、病情進展迅速且變化快，因此死亡率高，其中念珠菌感染病死率高達55%～70%。真菌感染按感染部位可主要分為表淺真菌感染和深部真菌感染兩大類。表淺部真菌只侵犯表淺角化組織(如皮膚，毛發、指甲等)，引起身體如頭、手足、體、股等癬癥，發病率高。深部真菌感染主要侵犯內臟、骨骼和中樞神經系統，并以白色念珠菌的繼發感染比較多見，致死率高，危害性較大［1-2］。現市面上所售藥物大多為西藥，如兩性霉素B、萘替芬、氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬等，這些藥物對于淺表部真菌感染難以完全治愈，容易復發，具有一定的毒副作用。而且近年來由于廣譜抗生素大量使用，以及一些免疫抑制劑的廣泛應用使耐藥株增多，真菌感染病日趨嚴重，因此尋找廣譜、高效、毒副作用小的抗真菌新藥具有十分重要的意義［3-4］。

中藥是中華民族的瑰寶，我國勞動人民幾千年智慧的結晶。中藥復方包括古代流傳下來的有確切療效的傳統方劑，也包括現代臨床使用的療效明確的一些新復方。幾千年來所積累的方劑數量多達數十萬，明代的《普濟方》所收載的方劑達61 739首，近年來我國科研人員對流傳下來的方劑更是費盡心血整理研究，僅1997年出版的《中醫方劑大辭典》中選收的方劑就達96 592首。各少數民族也積累了大量的藥方，常見的如藏藥有400多種，蒙藥500多種，維藥310種，壯藥70多種，彝藥324種，白藥151種，苗藥163種，等等。中藥是我國的傳統優勢資源，其價格低廉、效果確實。因此，尋找能夠治療淺表皮真菌感染的中藥并對其進行深入研究，尋找其活性部位或者單體，探明其物質基礎，提高藥物療效有著十分重要的意義和廣闊的市場前景。近年來，中藥現代化的研究遇到了一些難題和理論上的瓶頸，中藥往往由很多味中藥組成，包含的化學成分有成千上萬，有些復方往往由很多種化學成分共同作用，因此，中藥作用的化學成分和作用機理很難闡述清楚，對藥物的質量控制也造成了一定困難。而在國際上，上市藥物必須確定作用成分和作用機理，這就對中藥進一步研究、走向世界造成了很大的困難。一部分科研工作者試圖完全用西醫的理論體系來研究并尋找中藥中起作用的化學單體，但往往發現中藥化學成分是一個整體作用，在經過成分拆分后往往分開幾部分都沒有作用，這就要求我們要以創新的方法進行研究，盡快攻克中藥現代化中存在的難題［5-6］。

珊瑚蘚凈是一種治療足癬的民間藥，經臨床證明對足癬有很好的療效，目前還沒有對其有效成分和藥理學的相關研究。足癬病多由淺部或者深部真菌感染而生。引起足癬的真菌很多，主要有白色念珠菌、紅色毛蘚菌、須子樣毛蘚菌(石膏樣毛癬菌)等［7-9］。本研究擬以抗菌活性為指導分離珊瑚蘚凈的活性成分并初步研究珊瑚蘚凈的藥理作用。試驗采用瓊脂擴散法、微量稀釋法對珊瑚蘚凈藥敏活性進行測定［10］，并以珊瑚蘚凈抗白色念珠菌活性為指導，對珊瑚蘚凈進行分離純化，尋找其抗菌活性成分，探明其作用的物質基礎。通過掃描電鏡觀察給藥前后白色念珠菌外部形態的變化，初步了解其對白色念珠菌作用機理。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

紅色毛蘚菌(T.rubrum)ATCC294;

石膏樣毛蘚菌(Richophytion mentagrophytes)LZY8905;

白色念珠菌(Canidia Albicans)ATCC10231。

(以上菌種由中科院微生物保藏中心提供)。

1.2 試劑

正己烷、氯仿(分析純，北京化工廠);

SH1珊瑚蘚凈水煎劑提取物(自制);

L1兩性霉素B(sigma公司)。

1.3 儀器

高效液相色譜儀:Aglient 1200，Aglient Shimadzu LC-20高效液相色譜儀，

Waters HPLC2695-2487;

核磁共振儀:Bruker Avance 500MHz，Bruker AvanceⅢ400MHz，TMS 為內標，

2 D-NMR標準軟件—XWIN-NMR，version 2.6 software;

旋轉蒸發儀:RE-52A型，上海亞榮科技有限公司;

酶標以儀:TECNAⅡ-SAFIRE2酶標儀，瑞士TECAN集團公司;

真空凍干機:FD-1E-80，深圳三利試驗儀器公司;

掃描電鏡:日立S-3400N掃描電鏡。

1.4 培養基

LB培養基:胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，純凈水補齊1 000mL，121℃高壓20min。

土豆培養基:馬鈴薯200g沸水煮5min左右，葡萄糖20g，瓊脂16g，純凈水補齊1 000mL，121℃高壓滅菌20min。

沙氏培養基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂粉18g(固體)，純凈水補齊1 000mL，121℃高壓滅菌20min。

2 試驗方法

2.1 珊瑚蘚凈有效成分的初步分離

將珊瑚蘚凈用8～10倍體積用氯仿反復提取，合并提取濃縮得浸膏4.729g，將所得樣品用硅膠柱層析，洗脫液為正己烷—氯仿的梯度混合溶液 (體積比10∶0～4∶6)，結合薄層層析檢測結果，合并相似成分。將得到組分用旋轉蒸發儀濃縮成浸膏并稱量。

2.2 微量稀釋法測定珊瑚蘚凈抗菌活性

將硅膠柱色譜分離得到的 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四個組分用真空凍干機凍干至粉狀蒸干，并用沙氏培養基溶解至濃度為1 280μg/mL.并在96孔聚苯乙烯板中倍比稀釋，并分別接種白色念珠菌、紅色毛癬菌、須子樣毛癬菌懸液，使每孔終體積為100μL，48h后用肉眼直接觀察結果，小孔內完全抑制細菌生長的最小濃度為MIC值。

2.3 高效液相色譜(HPLC)分離Fra2主要成分

將fra2在真空凍干機凍干，用80% 甲醇溶解。溶液進行離心(12 000r/min，15min)，取上清，用HPLC分離并收集其中主要組分。

2.4 微量稀釋法測定Z1、Z2、Z3三種化合物抗白色念珠菌活性

將得到的化合物用微量稀釋法測定對白色念珠菌的抑菌效果(試驗方法同2.2)。

2.5 核磁共振儀鑒定化合物Z2結構

用核磁共振儀檢測單體化合物Z2(溶劑DMSO)，通過氫譜(1H-NMR)，碳譜(13C-NMR)，DEPC-NMR，HSQC-NMR，HMBC-NMR分析Z2的化學結構。

2.6 掃描電鏡觀察Z2對白色念珠菌細胞膜形態影響［11-14］

藥物在細胞膜內與脂醇(Ergosterol)結合而造成細胞膜通透性的改變，導致真菌細胞內的成分，鉀離子及其他成分如氨基酸、蛋白質等泄漏到膜外，破壞真菌正常代謝及抑制生長，細胞產生裂解而造成細胞死亡［11-13］。因此，擬采用本試驗觀察珊瑚蘚凈對白色念珠菌細胞膜的影響。將Z2在滅菌后的24孔聚苯乙烯板中倍比稀釋，并接種白色念珠菌菌懸液使每孔終體積為200μL，將載玻片放入24孔板所示各孔孵育48h后取出并在電鏡下觀察結果［14-16］。

3 試驗結果

3.1 珊瑚蘚凈有效成分的初步分離結果

將珊瑚蘚凈氯仿提取物用正己烷-氯仿體系進行梯度分離，得到Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四個流分，重量分別為 0.35g、1.23g、0.58g、0.89g。

3.2 微量稀釋法測定 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4 四種組分抗真菌藥敏試驗結果

試驗結果表明，Fra1、Fra2、Fra3、Fra4對紅色毛蘚菌、石膏樣毛蘚菌均無明顯抗菌效果。而Fra2對白色念珠菌有明顯抑制效果，最小抑菌濃度(MIC)達到40ug/mL(見表1)，而珊瑚蘚凈氯仿粗提物最小抑菌濃度(MIC)為640ug/mL，因此Fra2為珊瑚蘚凈的活性成分。

表1 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4抗白色念珠菌MIC值 (單位μg/mL)Tab.1 Fra1，Fra2，Fra3，Fra4 anti-candida MIC result

圖1 Fra2 HPLC結果Fig.1 Fra2 HPLCresult

3.3 高效液相色譜(HPLC)分離Fra2主要成分結果

由圖1可知，高效液相色譜在Fra2中共分離到三種主要化合物(圖中標示為1、2、3)，收集化合物，記做 Z1、Z2、Z3，稱重得到重量分別為 85mg，121mg，32mg。

3.4 微量稀釋法測定Z1、Z2、Z3三種化合物抗白色念珠菌藥敏試驗結果

由表2可知，化合物Z2的最小抑菌濃度(MIC)為10μg/mL，Z1、Z2均沒有明顯的抑菌效果，因此 Z2是 Fra2中的主要抑菌成分。

表2 Z1，Z2，Z3抗白色念珠菌MIC值 (單位μg/mL)Tab.2 Z1，Z2，Z3 anti-candida MIC result

3.5 核磁共振法(NMR)鑒定化合物Z2結構

經過NMR圖譜結果分析，Z2結構為:

命名為 1，3，4，6-4 氨基己烷(1，3，4，6-4 amino hexane)

圖2 化合物Z2的1 H-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.2 Z2 1 H-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖3 化合物Z2的13 C-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.3 Z213 C-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖4 化合物Z2的DEPT-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.4 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

3.6 掃面電鏡觀察Fra2對白色念珠菌細胞膜的影響結果

在藥物濃度為320μg/mL時(圖7)，白色念珠菌基本死亡，電鏡下幾乎看不到白色念珠菌細胞，只能看到少量沒有生長到一定體積細胞就發生破裂的白色念珠菌細胞。能看到少量散落的菌絲，細胞壁有明顯的褶皺。在藥物濃度為80μg/mL(圖8)時，在電鏡下能觀察到已經破裂的白色念珠菌細胞和菌絲體，細胞壁有明顯褶皺，與陽性對照兩性霉素B藥物濃度10μg/mL(圖12)下觀察到的結果相似。在藥物濃度為10μg/mL時(圖9)，在電鏡下未能觀察到已經破裂的白色念珠菌細胞，正常存活的細胞細胞壁有明顯褶皺。在藥物濃度為5μg/m(圖10)時，在電鏡下未觀察到破裂的白色念珠菌細胞，正常存活的細胞細胞壁未出現褶皺，菌體表面光滑，生長狀態正常，與陰性對照(圖11)觀察到的結果相似。從掃描電鏡結果可以看出，珊瑚蘚凈有效部位Fra2對白色念珠菌有明顯的抑制效果并呈現出對藥物的劑量依賴效應。

圖5 化合物Z2的HSQC-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.5 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖6 化合物Z2的HMBC-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.6 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖7 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為320μg/mL)Fig.7 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level320μg/mL)

圖8 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為80μg/mL)Fig.8 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level 80μg/mL)

圖9 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為10μg/mL)Fig.9 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level10μg/mL)

圖10 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為5μg/mL)Fig.10 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level 5μg/mL)

圖11 白色念珠菌掃描電鏡圖(陰性對照)Fig.11 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(negative control)

圖12 白色念珠菌掃描電鏡圖(兩性霉素B 10μg/mL)Fig.12 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(amphotericin B10μg/mL)

4 討論

珊瑚蘚凈是一種有效的抗真菌中成藥，將其用氯仿提取所得樣品再通過硅膠柱層析得到有效組分Fra2，經微量稀釋法測定，Fra2對白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)值為40μg/mL，有明顯的抑菌效果。用HPLC對Fra2進行純化得到三種主要化合物Z1、Z2、Z3，經藥敏試驗測定Z2最小抑菌濃度(MIC)值為10μg/mL，與珊瑚蘚凈水提劑SH1相比最小抑菌濃度提高了64倍，使藥物的作用效果顯著提高，為珊瑚蘚凈的有效作用成分。經過NMR鑒定Z2的化學成分為1，3，4，6-4氨基己烷。通過顯微鏡、掃描電鏡觀察發現，從珊瑚蘚凈中得到的單體化合物Z2可以破壞白色念珠菌的細胞膜并使白色念珠菌細胞裂解死亡。研究表明，化合物Z2是以活性為指導從珊瑚蘚凈中得到的抗白色念珠菌有效單體，是一種潛在的抗真菌新藥。因此，對Z2進行進一步研究，開發治療足癬的新藥，有著十分重要的意義和廣闊的市場前景。

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