氨基酸對嘔吐毒素誘導的肥育豬血液生理生化損傷的干預效應

陳明洪 ，尹 杰 ，鄧建文 ，吳苗苗 ，肖 昊 ，段杰林 ，方 俊 ，李鐵軍

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南省畜禽健康養殖工程技術中心，農業部中南動物營養與飼料科學觀測實驗站，湖南 長沙 410125；3.中國科學院大學，北京 100049；4.湖南農業大學動物科技學院，湖南 長沙 410128）

嘔吐毒素（vomitoxin）的主要成分是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）。DON是一種單端孢霉烯族毒素，它是一種由鐮刀菌屬產生的毒性代謝產物，現已證實禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌為主要產毒菌種[1]。DON在全球范圍內廣泛存在，其在全世界范圍都具有較高檢出率[2-3]。由于DON在不同動物體內有著不同的吸收、代謝、分布和排出的方式，因此不同動物對毒性敏感性也存在差異，其毒性作用大小依次為：豬、小鼠、大鼠、家禽和反芻動物[4]。嘔吐毒素能引起豬食欲下降、嘔吐、體重減輕、流產、死胎和弱仔等現象，抑制機體免疫力和降低抵抗力[5-6]。不僅如此，DON還具有細胞毒性和遺傳毒性，能抑制生物大分子如DNA、RNA、蛋白質的合成[7]，誘導細胞發生凋亡[8-9]。目前有關DON脫毒處理主要為物理、化學和生物脫毒方法，而從營養角度的研究尚無報道。功能性氨基酸（如谷氨酸、精氨酸、賴氨酸等）是機體中腸道細胞、淋巴細胞等快速分裂細胞的主要氮源和能量來源，在疾病的預防、控制感染以及機體損傷后的修復等過程中具有營養和免疫調節雙重作用[10-12]。試驗研究了飼糧添加酸性氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）和堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）對嘔吐毒素誘導的育肥豬臟器指數、血液常規指標和血液生化的損傷進行營養干預，以期從營養的角度為緩解嘔吐毒素的毒害作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

平均體重約為55 kg的二元雜（長×大）肥育豬30頭；F.graminearum R6576菌種（華中農業大學）；基礎飼糧配方參照NRC（1998豬營養需要標準（表1）；谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）。

1.2 飼糧處理

選用PDA培養基，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后在超凈工作臺接F.graminearum R6576菌種，置于28℃恒溫培養箱中培養5～6 d，將菌絲接種在羧甲基纖維素酯培養基（Carboxymethyl Cellulose，CMC）中，用接種針將菌絲打碎，1 L三角瓶中加入CMC液體培養基220 mL，置于28℃，200 r/min的恒溫振蕩搖床上培養5 d。將基礎飼糧平鋪于室內，厚度適中，然后將處理好的每CMC液體培養基溶液按40 mL/kg均勻噴灑在基礎飼糧上，攪拌，混勻。處理過程中保持飼料含水量均勻且相對濕度在20%左右，溫度28℃左右，處理7 d。將處理好的飼糧與未處理的基礎飼糧按1∶1混合均勻，按試驗設計要求加入分別加入氨基酸。試驗周期為60 d，共處理飼料8次，每次每組取樣2份裝入干凈自封袋中，標記日期及組別，－20℃保存，用于檢測DON含量。

1.3 試驗設計

健康肥育豬30頭，隨機分為6組，每組5頭，每頭為1個重復。分別為：CK組（基礎飼糧）、DON組（飼糧添加3.4 mg/kg嘔吐毒素）、Glu組（3.4 mg/kg嘔吐毒素＋2%Glu）、Asp組（3.4 mg/kg嘔吐毒素＋2%Asp）、Arg組（3.4 mg/kg嘔吐毒素+1%Arg）和 Lys組（3.4 mg/kg嘔吐毒素＋1%Lys）。試驗育肥豬飼喂至出欄（60 d，體重100 kg左右）。

1.4 樣品采集及測定

1.4.1 血常規檢測 于屠宰前1 d，清晨對空腹育肥豬用無菌注射器前腔靜脈采血10 mL/頭。將血液靜置15 min，3000 r/min離心20 min分離血清，分裝于EPPendorf管中，4℃保存，待測。用血液分析儀（南昌百特HL-2400）進行白細胞計數（WBC）、淋巴細胞百分（LYMPH）、中間值細胞百分比（MID）、中性粒細胞百分比（GR）、淋巴細胞絕對值（LYMPH）、中間值細胞絕對值（MO）、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞比積（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、紅細胞體積分布（RV）、平均血小板體積（MPV）、血小板壓積（PCT）和血小板分布寬度（PDW）等項目測定。

表1 基礎飼糧配方及營養水平 （%）

1.4.2 血清生化指標測定 同1.3.1采血樣，用BECKMAN公司CX4型全自動血液生化分析儀進行血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、γ-谷氨酰轉移酶、總蛋白（TP）和血糖（GLU）等指標測定。

1.4.3 臟器指數測定 所有試驗育肥豬試驗60 d屠宰。打開腹腔，分離心臟、肝臟、脾臟和腎臟，稱重記錄數據。臟器指數=臟器絕對重量/體重（g/kg）。

1.5 數據處理

試驗數據先用Excel 2003進行初步統計，然后用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析和Duncan氏多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。試驗數據以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 對臟器指數和肝臟形態學的影響

受嘔吐毒素的影響，心臟指數下降，其余臟器均有上升趨勢（見表2），但差異不明顯（P>0.05）。對于脾臟指數而言，添加1%的Lys較其余氨基酸組顯著下降（P＜0.05），但對于緩解嘔吐毒素對其影響效果不明顯（P>0.05），而酸性氨基酸與堿性氨基酸均能提高心臟、肝臟、脾臟和腎臟指數，從整體上來看，酸性氨基酸和堿性氨基酸對肥育豬臟器指數的緩解效果差異不顯著（P>0.05）。

2.2 對血液常規參數的影響

從表3中可知，與CK組相比，DON組白細胞數、中間值細胞百分比、中性粒細胞百分比、淋巴細胞絕對值、中間值細胞絕對值、血紅蛋白、平均紅細胞體積、平均血小板體積、血小板壓積均有所升高，其中平均血小板體積差異顯著（P＜0.05），其余差異不顯著。而與DON組比較，堿性氨基酸組中，添加1%Lys能顯著提高紅細胞數量（P＜0.05），而酸性氨基酸組的紅細胞數與DON組并無明顯差異。酸性氨基酸組中，添加2%Glu能顯著改善平均血小板體積（P＜0.05），而堿性氨基酸組的平均血小板體積與DON組差異不大，總體而言，4種氨基酸均能在一定程度上對嘔吐毒素誘導的肥育豬血液常規參數起到一定緩解作用，緩解效果的差異不顯著。

2.3 對血液生化指標的影響

肥育豬血液生化指標檢測結果見表4，與CK組比較，攝食嘔吐毒素的肥育豬血液中ALT含量有所下降，ALB、γ-谷氨酰轉移酶、TP和GLU均有不同程度上升，但差異均不明顯（P>0.05），與DON組比較，酸性氨基酸組中Asp組和堿性氨基酸組中Lys組均能呢能使ALT和γ-谷氨酰轉移酶含量降低，且差異顯著（P<0.05），Glu組ALB酶含量顯著下降（P<0.05），Arg TP 含量顯著下降（P<0.05），Glu、Arg、Asp均對嘔吐毒素誘導的肥育豬GLU含量升高有一定的緩解效果，但效果不顯著（P>0.05）。

表2 氨基酸對嘔吐毒素誘導的肥育豬臟器指數的干預效應 （g/kg）

3 討論

3.1 對臟器指數的影響

動物臟器指數即動物的臟器重量與體重之比，是生物醫學研究的重要基礎指標[13]，它不僅是進行病理學、毒理學研究和探討發病機理等研究時選擇動物的依據[14]，而且能夠反映臟器本身的結構改變及生理性功能狀態[15-17]。Wenkai指出[12]，功能性氨基酸在多種機體模型中均有緩解效果。試驗結果表明，與CK組比較，DON對肥育豬心臟指數的影響與伍力等[11]研究結果不同，導致這種現象的具體原因尚不清楚，可能是由于動物種類與毒素計量不一致導致。而與DON處理組比較，酸堿性氨基酸組肥育豬心臟、肝臟、脾臟和腎臟指數影響大多呈上升趨勢，且相比其他氨基酸組，添加1%Lys使脾臟指數下降。這一現象可能原因為人工處理的DON污染飼糧，毒性作用不強，肥育豬長時間食用含低劑量DON的日糧，對DON具有一定的耐受能力。

表3 氨基酸對嘔吐毒素誘導的肥育豬血常規參數的干預效應

3.2 對血常規參數的影響

血液由液體和有形細胞兩大部分組成，血常規檢驗的是血液的細胞部分。血液不停地流動于機體循環系統中，參與機體的代謝及每一項功能活動，

表4 氨基酸對嘔吐毒素誘導的肥育豬血液生化指標的干預效應

因此血液對保證機體的新陳代謝、功能調節以及內外環境的平衡起重要作用。血液中的任何有形成分發生病理變化，都會影響到組織器官。Tiemann等[18]報道DON具有較強的細胞毒性，影響細胞增殖，從而導致細胞數量下降。趙青等[19]用DON標準品為原料，通過灌胃和靜脈注射2種給藥途徑，研究該毒素對豬體內血常規指標的影響，發現2種方式均對豬血常規參數不會造成顯著影響。試驗中飼喂嘔吐毒素能刺激白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、中間值細胞、血紅蛋白的增值，但無顯著性差異，這一試驗結果與趙青等[19]人報道相符。平均血小板體積顯著上升，表明DON能夠引起肥育豬機體內炎癥反應，而添加2%Glu能使情況顯著改善。原因可能是由于谷氨酸能夠通過iNOS途徑在大腦組織中表達，間接調節動物免疫活性[20]，對平均血小板的作用還可能與Glu參與神經調節有關。

3.3 對血液生化的影響

血液生理生化是反映動物機體生理機能的重要指標，也是臨床醫療和科學研究的重要依據[21]。何成華[22]分別用1和1.5 mg/kg DON對鯉魚進行攻毒，結果表明鯉魚血清中GOT、GPT和AKP活性上升，且GOT活性顯著上升，血清中TP、ALB含量是反映肝臟蛋白質合成能力的重要指標。血清中TP含量反映了機體蛋白質的吸收和代謝情況，并能反映體液免疫的情況。在DON的刺激下，肥育豬血液中ALT、ALB、γ-谷氨酰轉移酶、TP和GLU均出現不同程度上升，而γ-谷氨酰胺轉移酶和ALT是反映肝臟病變的兩個重要指標，TP和ALB也能夠一定程度上反映肝臟的合成功能，這說明嘔吐毒素已經對肥育豬肝臟造成一定程度的損傷。而添加2%Glu和添加1%Lys能使ALT和r-谷氨酰轉移酶含量顯著降低，添加2%Glu使ALB酶含量顯著下降，1%Arg使TP含量顯著下降。原因可能是動物長期進食含嘔吐毒素的飼糧使機體處于長時間應激狀態，對肝臟解毒功能造成影響。添加的4種氨基酸都能顯著改善飼喂DON肥育豬的血液生化指標，調節肝功能障礙，對DON造成的負面影響有緩解效果。

4 結論

飼糧中添加3.4 mg/kg的嘔吐毒素對肥育豬臟器指數、血液常規指標和血液生化指標造成了不同程度的損傷，而添加酸性氨基酸（Glu、Asp）和堿性氨基酸（Arg、Lys）對于緩解臟器病變、改善血液生理生化指標具有一定的效果。

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