醫院內鮑曼不動桿菌感染分布特征及其耐藥機制

李 娟，郝邯生，王 悅，張利娟

(1天津醫科大學研究生院，天津 300070;2武警后勤學院附屬醫院;3天津醫科大第二醫院)

鮑曼不動桿菌(Ab)是院內感染的重要條件致病菌［1］，近年來臨床Ab分離率逐漸增高，耐藥性不斷加強，并出現多重耐藥、泛耐藥菌株，給臨床治療帶來一定困難［2］。Ab可以具有多種耐藥機制，如產生藥物鈍化酶或修飾酶、改變藥物作用靶點、外膜蛋白缺失或外排泵高表達等［3］。整合子［4］作為可移動遺傳元件一直是科研人員關注的重點，它可以捕獲、整合并表達外源基因，在細菌耐藥、多重耐藥演進中扮演重要的角色。本研究以分離自天津市某三級醫院住院患者的Ab為實驗對象，分析其院內感染分布特征和耐藥性，并對部分收集自重癥監護病房(ICU)的Ab攜帶Ⅰ類整合子情況進行了研究。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 選擇2010年7月～2011年6月在天津市某三級醫院住院患者分離出的Ab 616株(去除重復菌株)，所有菌株由 MicroScan WalkAway-96SI全自動微生物分析儀進行菌種鑒定。隨機選取其中收集自ICU的57株檢測Ⅰ類整合子。質控菌株大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為該院保存。

1.2 方法

1.2.1 Ab抗菌藥物敏感試驗 帶有菌液的鑒定藥敏板放入MicroScan WalkAway-96SI全自動微生物分析儀，24 h后儀器會自動報告菌株及其藥敏情況。頭孢哌酮/舒巴坦和多粘菌素B藥敏實驗采用紙片擴散法(Kirby-Bauer)。

1.2.2 整合子基因檢測 ①細菌DNA的提取及基因檢測:采用煮沸法［5］提取細菌DNA，－20℃保存。②PCR檢測菌株中Ⅰ類整合酶基因、Ⅰ類整合子可變區，志賀菌N5經測序證實攜帶Ⅰ類整合子，為本實驗的陽性對照。反應總體系 25 μL:TaKaRa Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板2 μL，加入無菌去離子水至25 μL。Ⅰ類整合酶基因的引物序列為:上游引物:5'-ACATGTGATGGCGACGCACGA-3'，下游引物:5'-ATTTCGGTCCTGGCTGGCGA-3'，目的片段為569 bp，PCR反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 個循環，72℃ 5 min;Ⅰ類整合子可變區的引物序列為:上游引物:5'-GGCATCCAAGCAGCAAG-3'，下游引物:5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'，目的片段大小可變，PCR反應條件:94℃ 5 min，94℃ 45 s，53℃35 s，72 ℃ 2 min，35 個循環，72 ℃ 5 min。③PCR產物測序:各選2株片段大小一致的可變區PCR產物送上海英駿生物工程公司測序，結果在GenBank中用BLAST程序進行比對，以確定可變區的基因盒類型及排列順序。

1.2.3 統計學方法 采用WHONET5.4統計軟件，ICU和非ICU來源的Ab的耐藥率比較采用χ2檢驗，整合子陽性、陰性Ab的耐藥率比較采用Fisher確切概率法。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株來源 616株Ab中，來自呼吸道標本512株(83.1%)、傷口膿液標本 34 株(5.5%)、血液標本20株(3.2%)、胸腹水和其他無菌體液標本13株(2.1%)、腦脊液標本 6 株(1.0%)，其他標本 31株(5.0%)。

2.2 科室分布 616株 Ab中，來自 ICU 412株(66.9%)，包括腦系科 ICU 269 株(43.7%)、綜合ICU 143 株(23.2%);非 ICU 204 株(33.1%)，包括腦系科 62 株(10.1%)、呼吸科29 株(4.7%)、燒傷科27株(4.4%)、其他內科 54 株(8.8%)和其他外科32 株(5.2%)。

2.3 Ab對各類抗菌藥的耐藥性情況 616株Ab中，均對多粘菌素B不耐藥，其次分別為頭孢哌酮/舒巴坦 85株(13.8%)、左氧氟沙星 282株(45.8%)、氨芐西林/舒巴坦 339 株(55.0%)、復方新諾明 395株(64.1%)、頭孢他啶 395株(64.1%)、阿米卡星396 株(64.3%)、頭孢曲松 397株(64.4%)、頭孢噻肟 408 株(66.2%)、環丙沙星413 株(67.0%)、亞胺培南 431 株(70.0%)、妥布霉素 435株(70.6%)、替卡西林/棒酸 436株(70.8%)、慶大霉素443 株(71.9%)、頭孢吡肟 471株(76.5%)、哌拉西林472 株(76.6%)。多重耐藥Ab的檢出率為76.5%(471/616)。

2.4 ICU與非ICU Ab耐藥情況比較 見表1。

表1 ICU與非ICU Ab耐藥情況比較［株(%)］

2.5 基因檢測及序列分析結果 57株Ab中，Ⅰ類整合酶陽性43株(75.4%)，可變區陽性39株(陽性率為68.4%)。34株檢測出大小為2310 bp的產物，經BLAST比對，所含的耐藥基因盒為 aacA4-catB8-aadA1;5株檢出2470 bp的產物，經BLAST比對顯示所含的耐藥基因盒為aacC1-orfA-orfB-aadA1。見圖 1、2。

圖1 Ⅰ類整合酶基因擴增結果

圖2 Ⅰ類整合子可變區擴增結果

2.6 ICU來源的AbⅠ類整合子陽性株與陰性株耐藥情況比較 Ab對多粘菌素B均敏感，不納入比較范圍。具體結果見表2。

表2 Ⅰ類整合子陽性與陰性Ab耐藥率比較［株(%)］

3 討論

Ab廣泛分布于土壤、水、醫院環境，并易在住院患者皮膚、口腔、呼吸道、胃腸道及泌尿生殖道等部位定植。Ab被認為是一種低毒力病原菌［6，7］，對其毒力因子的研究目前還處于初級階段，它主要引起免疫力低下患者(尤其是重癥監護病房患者)呼吸機相關性肺炎、敗血癥、繼發性腦膜炎、外科手術部位感染等［8，9］。該菌強大的環境適應能力及快速獲得耐藥性的能力使其極易引起醫院內感染的暴發流行，給臨床工作者帶來很大的困擾。對Ab進行耐藥性監測，及時掌握該菌院內感染的分布情況，對指導臨床合理使用抗生素及防控院內感染流行意義重大［10］。本研究發現，該院Ab耐藥、多重耐藥情況十分嚴重。檢測的16種抗菌藥物中，Ab對13種藥物的耐藥率均在55.0%以上，其中包括對碳青霉烯類—亞胺培南耐藥。未發現對多粘菌素B耐藥的菌株，Ab對頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為13.8%，提示臨床醫生仍可以將其作為對抗Ab的一線用藥。在分離的616株Ab中，呼吸道標本占83.1%，遠高于其他類型標本，且主要集中在 ICU病房(66.9%)，說明Ab可以引起住院患者(尤其是住ICU患者)呼吸道的細菌感染或定植，與院內獲得性呼吸系統感染及呼吸機相關性肺炎關系密切。

整合子由 Stokes等［11］首次提出，定位于染色體、質粒或轉座子上，它由5'保守區(5'CS)、3'保守區(3'CS)和兩者之間的可變區組成。5'CS是整合子的基本結構，包括編碼整合酶的基因、整合子重組位點和整合子可變區啟動子;可變區含有一個或多個耐藥基因盒;3'CS包括qacEΔ1和sul1，介導季銨鹽類化合物和磺胺類藥物的耐藥。根據整合酶基因序列的不同，可將整合子分為6類，其中以Ⅰ類整合子最為常見［12］。研究表明，Ⅰ類整合子普遍存在于臨床上分離的革蘭陰性菌中，介導細菌對氨基糖苷類、β-內酰胺類、氯霉素等抗菌藥物的耐藥［13，14］。本次監測的Ab主要分離自ICU，且ICU來源的Ab耐藥率明顯高于非ICU來源的Ab，故隨機收集了ICU來源的57株Ab，研究Ⅰ類整合子與其耐藥的關系。研究發現，57株Ab中75.4%攜帶Ⅰ類整合子，68.4%可變區攜帶耐藥基因盒，且本組Ab可變區陽性株中87.2%攜帶aacA4-catB8-aadA1形式的耐藥基因盒，推斷該院ICU病房內可能存在Ab克隆株的水平傳播。Ⅰ類整合子所攜帶的耐藥基因aacA4編碼對阿米卡星、奈替米星、妥布霉素耐藥，aadA1編碼對壯觀霉素、鏈霉素的耐藥性，aacC1編碼對慶大霉素的耐藥性，catB8編碼對氯霉素耐藥。從分子生物學角度上來看，該院ICU來源的Ab中Ⅰ類整合子主要介導該菌對氨基糖苷類、氯霉素和磺胺類耐藥，但是通過對耐藥表型的分析比較發現，Ⅰ類整合子陽性株對左氧氟沙星、環丙沙星、哌拉西林、頭孢吡肟等抗菌藥物的耐藥率也高于Ⅰ類整合子陰性株，我們認為在Ab中可能存在與Ⅰ類整合子密切相關的其他耐藥機制，如Ⅰ類整合子下游連接了可以攜帶耐藥基因的ISCR1元件等等，有待于進一步研究。

［1］陳東科，崔巧珍，胡云建.醫院內不動桿菌流行現狀及耐藥性分析［J］.中華流行病學雜志，2003，24(7):640-641.

［2］Le Hello S，Falcot V，Lacassin F，et al.Molecular epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in New Caledonia［J］.Clin Microbiol Infect，2008，14(10):977-981.

［3］Zavascki AP，Carvalhaes CG，Picao RC，et al.Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter banmannii:resistance mechanisms and implications for therapy［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2010，8(1):71-93.

［4］Labbate M，Case RJ，Stokes HW.The integron/gene cassette system:an active player in bacterial adaptation［J］.Methods Mol Biol，2009，532:103-125.

［5］Pitout JD，Thomson KS，Hanson ND，et al.Plasmid-mediated resistance to expanded-spectrum cephalosporins among Entetobacter aerogenes strains［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42(3):596-600.

［6］Peleg AY，Seifert H，Paterson DL.Acinetobacter baumannii:emergence of a successful pathogen［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(2):538-582.

［7］Gordon NC，Wareham DW.Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii:mechanisms of virulence and resistance［J］.Int J Antimicrob Agents，2010，35(3):219-226.

［8］Munoz-Price LS，weinstein RA.Acinetobacter infection［J］.N Engl J Med，2008，358(12):1271-1281.

［9］Maragakis LL，Perl TM.Acinetobacter baumannii:epidemiology，antimicrobial resistance，and treatment options［J］.Clin Infect Dis，2008，46(8):1254-1263.

［10］習慧明，徐英春，朱德妹，等.2010年中國CHINET鮑曼不動桿菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12(2):98-104.

［11］Stokes HW，Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions:integrons［J］.Mol Microbiol，1989，3(12):1669-1683.

［12］Rowe-Magnus DA，Guerout AM，Mazel D.Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes［J］.Mol Microbiol，2002，43(6):1657-1669.

［13］Cornaglia G，Giamarellou H，Rossolini GM.Metallo-beta-lactamases:a last frontier for beta-lactams［J］.Lancet Infect Dis，2011，11(5):381-393.

［14］Domingues S，Harms K，Fricke WF，et al.Natural transformation facilitates transfer of transposons，integrons and gene cassettes between bacterial species［J］.PLoS Pathog，2012，8(8):e1002837.