枸杞多糖對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

王玉彩，張玉濤，王家君

(1齊河縣人民醫院，山東 齊河 251100;2山東大學附屬齊魯醫院)

枸杞多糖(LBP)是枸杞子的主要功效成分。近年研究表明，其具有增加免疫力、抗氧化、抑制細胞凋亡的作用。2007年5月～2008年9月，我們觀察了LBP對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級、雄性、健康SD大鼠60只，鼠齡4個月，體質量(257±25)g，由青島市藥檢所動物中心提供，批號:DK120415。LBP由寧夏中藥廠提供純品。超氧化物歧化酶(SOD)放射免疫分析試劑盒由北京華清生化技術研究所提供。Fas、bcl-2兔抗鼠單克隆抗體及SABC免疫組織化學試劑盒均由博士德生物制劑公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 隨機將大鼠分為對照組、模型組、LBP處理組，各組20只。大鼠心肌缺血再灌注模型［1～3］:實驗組、LBP 處理組在 1.55 mol/L烏拉坦5 mg/g靜脈麻醉下，仰位固定，標準Ⅱ導聯心電圖檢測，連接氣管插管待開胸后聯接人工呼吸機(潮氣量為 2.0 L/100 mg，頻率 50次/min)。在胸骨左緣旁0.5 cm處縱行切開第3～5肋，剪開心包，暴露心臟，結扎冠狀動脈前降支，同時將一根直徑2 mm塑料管置于結扎線與冠狀動脈之間，拉緊結扎線使塑料管壓迫引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血(ST段弓背向上抬高0.2 mV以上)。缺血35 min后，抽去塑料管，進行再灌注120 min。兩組于冠脈結扎和再灌注前1 min分別由左心腔緩慢注射等量的生理鹽水或1 mg/kg LBP。模型組有4只、LBP處理組2只大鼠死亡。

1.2.2 血清SOD含量檢測 再灌注結束后，立即從大鼠左心室取血0.5 mL，靜置20 min，3000 r/min離心10 min，取血清，采用SOD放射免疫分析試劑盒直接測定SOD含量。

1.2.3 Fas、bcl-2蛋白的表達檢測 采血后處死動物，取出心臟，生理鹽水反復沖洗后，于多聚甲醛固定液中固定24 h。心肌組織經過固定后，常規沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、連續切片、貼片于涂有多聚賴氨酸的載玻片上備用。采用HE染色觀察各組心肌細胞的損傷情況，采用免疫組織化學法觀察心肌組織中 Fas、bcl-2蛋白的表達。采用 OLYMPUS、BX50獲得顯微圖像。免疫組化染色結果利用美國Sample PCI圖像分析系統進行定量分析。每張切片以組織間質空白處入射光的值為定標。

1.2.4 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件，計量資料以表示，比較采用q檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織學變化 對照組HE染色示心肌細胞結構清晰，層次清楚，無細胞水腫;模型組HE染色可見細胞水腫，部分細胞結構不清，密度不均，有細胞簇聚現象;LBP處理組HE染色可見細胞水腫明顯減輕。

2.2 各組Fas、bcl-2免疫組化染色及血清SOD含量比較 見表1、圖1。

表1 Fas、bcl-2免疫組化染色及血清SOD含量測定結果()

表1 Fas、bcl-2免疫組化染色及血清SOD含量測定結果()

注:與對照組、模型組比較，*P ＜0.05;與模型組比較，#P ＜0.05

組別 n Fas bcl-2 SOD(ng/mL)對照組20 0.216 ±3.021 0.389 ±0.012 615.400 ±20.100模型組 16 0.504 ±2.587* 0.201 ±0.010* 904.200 ±32.150*LBP 處理組 18 0.387 ±2.605*#0.376 ±0.007# 757.600 ±27.200*#

圖1 心肌Fas、bcl-2免疫組化染色(×100)

3 討論

心肌缺血組織再灌注后可引發一系列復雜的反應，使組織細胞損傷繼續存在，這種血液再灌注使缺血性損傷進一步加重的現象即為缺血再灌注損傷。這一過程涉及許多免疫組織病理生理過程，其中起主導作用的是自由基產物堆積、缺氧和微循環改變等，最終導致細胞的壞死和凋亡［4］。

在缺血再灌注條件下，氧自由基為主要誘導因子，有多條細胞信號轉導通路參與介導心肌細胞的凋亡。SOD是人體中一種內生性清除氧自由基的主要酶系，其作用可以特異性地催化氧自由基發生歧化反應，清除對體內有毒性作用的自由基，使其產生和清除處于動態平衡之中。任何增強氧化作用和降低抗氧化作用的因素均可破壞這一平衡，導致一系列的病理生理異常［5］。研究表明，LBP可以增強紅細胞攜氧能力和變形能力，具有調節微循環的流態和微循環周圍狀態的作用，從而降低冠脈阻力，改善心肌缺氧;而且對氧自由基具有清除作用，可抑制脂質過氧化反應，抑制細胞凋亡，故具有保護心肌細胞的作用［6］。在本實驗中，模型組血清SOD比對照組明顯升高，說明心肌缺血后生成了大量的自由基，從而對心肌造成損傷;而LBP處理組給予LBP后，血清SOD含量比模型組明顯下降。說明LBP可以抑制可抑制脂質過氧化反應，清除自由基。

細胞凋亡是細胞死亡的一種重要形式，即程序性細胞死亡。研究發現，凋亡的發生與許多基因的調控有關［7］。許多重要的信號分子和信號事件參與了凋亡過程，如bcl家族、Fas/Fas-L等。Fas又稱Apo-1，現名為CD95分子，屬腫瘤壞死因子/神經生長因子受體家族成員，是細胞表面的凋亡信號受體［8］。Fas具有誘導細胞凋亡的能力，它可以和Fas配基或Fas抗體相互作用而導致表達Fas的細胞發生凋亡。在細胞凋亡過程中，bcl-2家族成員也起著至關重要的作用，是細胞凋亡的抑制基因［9］。研究表明，其過度表達能夠抑制許多因素引起的細胞凋亡。在本實驗中，模型組大鼠心肌組織中Fas的表達明顯高于對照組，bcl-2的表達明顯低于對照組。這說明在心肌缺血再灌注過程中，心肌細胞發生了凋亡;而LBP處理組大鼠的心肌組織中Fas的表達明顯低于模型組，bcl-2的表達明顯高于模型組。說明LBP抑制了心肌細胞的凋亡。

本實驗中HE染色顯示，對照組心肌細胞結構清晰，層次清楚，無細胞水腫;模型組HE染色可見細胞水腫，部分細胞結構不清，密度不均，有細胞簇聚現象;LBP處理組HE染色可見細胞水腫明顯減輕。這表明模型組的心肌組織損傷嚴重，而LBP處理組損傷減輕。

總之，LBP通過清除缺血再灌注后血清中的自由基，降低了血清中SOD的含量，促進了bcl-2在心肌細胞的表達，抑制了Fas蛋白的表達，從而抑制了心肌細胞的凋亡，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。

［1］龔躍波，齊國先，李戈，等.丹紅注射液對心肌缺血再灌注大鼠血清一氧化氮合酶、內皮素-1的影響［J］.中外醫療，2007，26(24):32-33.

［2］張新寧，呂琪，張永亮，等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改進［J］.武警醫學院學報，2008，17(11):941-943.

［3］楊簡，楊俊，丁家望，等.大鼠心肌缺血-再灌注損傷模型的改良及實驗觀察［J］.中國老年學雜志，2008，28(10):961-963.

［4］徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛生出版社，2002:1834.

［5］姜生禮，楊渭臨，朱丹.老年急性腦梗塞患者血漿LPO和紅細胞SOD測定的臨床意義［J］.陜西醫學雜志，2000，29(11):686-687.

［6］方建國，丁水平，田庚元.枸杞多糖藥理作用與臨床應用［J］.醫藥導報，2004，23(7):484-485.

［7］Gerschenson LE，Rostello RJ.Apoptpsis:a different type of cell death［J］.FASEB J，1992，6:450.

［8］Itoh N，Yonehara S，Ishii A，et al.The polypeptide encoded by the cDNA for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis［J］.Cell，1991，66(2):233-243.

［9］Hockenbery D，Nunez G，Milliman C，et al.Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death［J］.Nature，1990，348(6299):334-336.