MMP-9和uPA在腦膠質瘤中的陽性表達及意義

高建洲，孔 昕，柳紅艷，郭艷峰，聶栓鎖，賀 龍，董超穎，李蘭梅

(1邯鄲市第一醫院，河北 邯鄲 056002;2邯鄲市中心醫院;3河北工程大學醫學院)

腦膠質瘤是顱內最常見且極具破壞性生長的腫瘤之一，浸潤能力強，復發率高，治愈率低，加之手術、放療及化療等治療手段缺乏特異性，是神經外科治療的難題。腦膠質瘤的發生、發展及浸潤的機理目前尚不十分清楚，其中腫瘤細胞外基質(ECM)的降解、癌基因的活化、抑癌基因的失活等均與其惡性程度和浸潤密切相關。基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)屬明膠酶類，對ECM的降解、組織重建以及細胞內多種可溶性因子的調控起重要作用。尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種絲氨酸蛋白水解酶，參與或調節腫瘤細胞的遷移和侵襲過程，在腫瘤浸潤和微血管生成中起重要作用。2009年10月～2012年6月，我們觀察了腦膠質瘤組織、正常腦組織中MMP-9、uPA的陽性表達情況，并探討其與患者臨床病理特征的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在邯鄲市第一醫院行膠質瘤根治性切除的腦膠質瘤患者50例(觀察組)，均經影像學檢查和病理診斷確診，所有患者手術前未行化療或放療。其中男32例、女18例，年齡9～76(46.3 ±15.6)歲;按 WHO(2000 年)神經系統腫瘤分類標準明確病理診斷(分類和分級):Ⅰ級8例、Ⅱ級16例、Ⅲ級16例、Ⅳ級10例，為了方便統計，將Ⅰ、Ⅱ級歸為低級別組，Ⅲ、Ⅳ級歸為高級別組。同期取本院腦外傷顱內減壓手術切除的正常腦組織標本10份(對照組)，其中患者男8例、女2例，年齡10～69(40.1±13.2)歲，均經影像學檢查和病理診斷確診為正常腦組織。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作 所有組織經中性甲醛固定，石蠟包埋。標本經連續切片，厚度4 μm，進行HE染色。每一組織標本由2位病理專家作2次診斷，并在HE切片上根據典型病理部位作標記，即組織定位;制作微陣列蠟塊，選用特殊工具在空白蠟塊上均勻地打出小孔(直徑1.0 mm)，然后根據HE切片上的精確范圍在供體組織蠟塊相應位置獲取所要組織芯片，放入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號，所有組織整齊排列，制成組織芯片蠟塊。對組織芯片蠟塊連續切片，制成組織芯片，均設有平行對照。

1.2.2 免疫組化的制作 標本經連續切片，厚度4 μm，行免疫組化S-P染色，常規免疫組化S-P試劑盒，鼠抗人MMP-9單克隆抗體和鼠抗人uPA單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。方法操作按試劑盒說明書進行，取已知腫瘤組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 結果判斷 MMP-9和uPA陽性定位于細胞質，以在細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性信號。按照Tanaka于2000年改良的定量記分法［1］:每張切片在陽性表達較高區隨機選擇5個高倍鏡視野(×400)，連續計數至少1000個腫瘤細胞。計算陽性細胞百分率和評定顯色強度。首先，依照陽性細胞所占的百分率打分，小于5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，大于75%為4分;再依照染色強度分級打分，未顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分(染色深淺與背景著色對比)。染色強度與陽性細胞百分率乘積分為4個等級，即0～1為陰性(－)，2～4分為低表達(+)，5～8分為中表達(++)，9分以上為高表達(+++)。為了減少人為因素造成的判斷誤差，由2名高年資病理醫師逐一觀察同一切片，以2人觀察結果核對后作為最終評定結果。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗。相關分析采用Spearman相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織芯片質量 制作陣列蠟塊過程中，有2片組織芯片脫落，其他組織芯片排列整齊，無組織折疊，實際有效芯片58片，占總樣本量的96.67%。

2.2 MMP-9和uPA的陽性表達與患者臨床病理特征的關系 正常腦組織中MMP-9、uPA全部弱表達，腦膠質瘤組織中MMP-9、uPA的陽性表達分別為37(74.0%)、39(78.0%)例，兩組比較 P 均 ＜0.05。MMP-9、uPA陽性表達與腦膠質瘤患者性別、年齡、WHO分期的關系見表1。

表1 MMP-9和uPA陽性表達與腦膠質瘤患者性別、年齡、WHO分期的關系

2.3 腦膠質瘤組織中 MMP-9與 uPA的關系Spearman相關分析顯示，uPA的陽性表達與MMP-9的陽性表達呈正相關(r=0.456，P ＜0.05)。見表2。

表2 MMP-9和uPA在腦膠質瘤組織中表達的相關性分析(例)

3 討論

組織芯片由Kononen等［2］于1998年率先報道，其后得到了廣泛的應用，研究內容包括膀胱移行細胞癌、結直腸癌、肺癌等，而膠質瘤方面的研究較少。由于組織標本及待測目的基因數量較多，采用常規病理學方法耗時、費力，且實驗條件難以統一。因此，我們采用組織芯片技術結合免疫組織化學方法檢測目的基因的陽性表達，極大地提高了效率，減少了時間及資金的耗費，同時可平行地研究組織細胞形態及蛋白的表達，避免了傳統技術在不同實驗條件下結果的差異，對比性和重復性強。

惡性腦腫瘤占全身腫瘤的1% ～3%［3］，其中膠質瘤發生率最高，約占全部顱內腫瘤的46%［4］。隨著膠質瘤惡性程度的增高，2年存活率也隨之下降［5］。由于膠質瘤系浸潤性生長，它和正常腦組織間沒有明顯界限，難以完全切除，對放療、化療不甚敏感，非常容易復發。同時，化學藥物和一般抗腫瘤的中藥因血腦屏障等因素的影響，療效也不理想。因此，腦膠質瘤至今仍是全身腫瘤中預后最差的腫瘤之一。浸潤性生長是膠質瘤的重要生物學特性，又是膠質瘤復發的根源，腫瘤的惡性程度越高，其浸潤能力越強。呈浸潤生長的膠質瘤，一方面沿著白質纖維突破血腦屏障，向鄰近的腦組織生長;另一方面，通過降解基底膜，破壞血腦屏障，完成浸潤性生長。在活組織中，ECM主要成分是Ⅳ型膠原，它的降解成為細胞侵襲與轉移的關鍵因素，其中基質金屬蛋白酶(MMPs)和uPA在ECM的重塑中起關鍵的作用。

MMPs是一個大家族，其中MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶，位于染色體20q11.1～13.1，26～27 kbp，具有 13個外顯子和 9個內含子。MMP-9主要由巨噬細胞、結締組織細胞和某些腫瘤細胞合成分泌，它可以降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ、Ⅺ型膠原［6］。腫瘤發生時由具有轉移傾向的腫瘤細胞自身或誘導其他細胞大量分泌MMP-9，使腫瘤細胞可以沿著受損的基底膜向周圍組織浸潤;它還能降低腫瘤細胞之間的黏附性，使腫瘤細胞容易脫離原發灶，提高腫瘤細胞的浸潤和游走能力，最終導致惡性腫瘤的浸潤及轉移［7］。本實驗中，我們使用腦膠質瘤組織和正常腦組織制備成的組織芯片來檢測MMP-9的表達情況。結果顯示，MMP-9的陽性表達明顯高于正常腦組織中的陽性表達，且WHO分期高級別組的陽性表達高于低級別組，表明在膠質瘤的生長過程中，MMP-9通過降解ECM，為腫瘤細胞向周圍正常腦組織侵襲提供通路和空間，促進膠質瘤的侵襲性生長。

uPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，uPA能將纖溶酶原激活為纖溶酶，纖溶酶和尿激酶自身都能降解ECM和基底膜，參與或調節腫瘤細胞的遷移和侵襲過程，在腫瘤侵潤和微血管生成中起重要作用，最終導致ECM的降解和基底膜屏障的突破［8］。目前認為，uPA是刺激腫瘤血管形成和腫瘤侵襲性生長過程中的重要因子［9］。有報道［10，11］顯示，uPA 在多種惡性腫瘤中均有過表達。本研究顯示，uPA蛋白結在腦膠質瘤組織中呈過度表達，在正常腦組織中不表達。uPA的表達在不同級別膠質瘤中差異有顯著性，膠質瘤惡性程度越高，uPA的陽性表達越強，表明uPA在膠質瘤的浸潤中起著重要的作用。

研究發現，uPA在與細胞表面的受體結合后，催化纖溶酶原轉變成纖溶酶，活性纖溶酶還能激活MMP-3、MMP-9、MMP-12 和 MMP-13 等 MMPs的前體，活化的MMPs可進一步降解ECM，特別是降解其中的基質和Ⅳ型膠原，對細胞遷移和腫瘤侵襲轉移過程中ECM的降解有重要作用［12］，本實驗研究結果與上述研究相一致。在腦膠質瘤組織中uPA蛋白高表達，同時MMP-9也高表達，而且兩者具有顯著正相關，提示uPA可能通過促進MMP-9表達上調，從而增強腫瘤細胞侵襲力，促進腫瘤細胞的侵襲、轉移。

綜上所述，我們認為MMP-9、uPA的陽性表達可能與腦膠質瘤的發生及惡性程度有關。

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