辣木莖葉中水溶性多糖的提取及抗氧化活性的研究

梁鵬，甄潤英

（1.天津農學院食品科學系，天津 300384；2.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384）

辣木莖葉中水溶性多糖的提取及抗氧化活性的研究

梁鵬1，2，甄潤英1，2

（1.天津農學院食品科學系，天津 300384；2.天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384）

摘 要：主要探討辣木莖葉中水溶性多糖的提取工藝條件以及抗氧化活性。以辣木莖葉干粉為原料，采用水為提取劑，通過單因素和正交試驗對浸提溫度、浸提時間及料液比進行研究；采用水楊酸法和鄰苯三酚法分別測定辣木多糖對羥自由基以及超氧陰離子的清除率，以確定提取物的抗氧化活性。實驗條件下辣木莖葉多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶20（g/mL）、浸提溫度80℃、浸提時間120 min，在此條件下，辣木粗多糖的提取率可達5.66%；多糖提取物對羥自由基及超氧陰離子均有清除作用，且隨著提取物濃度的提高對二者的清除作用逐漸增強，存在劑量效應關系。清除作用的半數抑制率（IC50）分別是7.252 8 mg/mL和2.501 1 mg/mL。

關鍵詞：辣木；多糖；提取工藝；抗氧化活性

植物多糖常見的有枸杞多糖、黃芪多糖、人參多糖等[1]。我國對多糖的研究起步于20世紀70年代，越來越多的人們把目光投向植物多糖，因此植物多糖的提取成為研究工作的焦點之一[2]。目前植物多糖提取的方法主要包括：溶劑提取法、酶解法、超濾法、酸提法、堿提法、超聲波強化法、微波法等[3]。

辣木（Moringa oleifera）又稱鼓槌樹（Drumsticktree），為辣木科辣木屬植物，起源于印度西北部的喜馬拉雅山南麓。研究發現，辣木除了具備豐富的營養外，還用作治療糖尿病、高血壓、皮膚病、免疫力低下、貧血、骨骼疾病、抗憂郁、關節炎、消化器官腫瘤等疾病的傳統藥材[4]。辣木作為一種功能性植物，有著廣闊的的開發前景[5]。辣木全株都可利用，營養物質種類多，富含 VA、VB、VC、VE及鈣、鉀、鐵等礦質營養元素，此外還含有人體必需的各種氨基酸和微量元素等，其營養價值與現代營養學家稱為“人類營養的微型寶庫”的螺旋藻相當。已研究發現的一些化學物質如：具有高度的抗氧化能力的α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚，抗腫瘤成分的β-谷甾醇、硫代氨基甲酸鹽，高效殺菌作用的鳳尾辣木素、辣木素，具有凈水功能的辣木蛋白質，促進植物生長的玉米素等[6]。辣木多糖是辣木中重要的有效成分之一，有很廣泛的利用價值[1]。

本試驗將以辣木莖葉干粉為原料，以水為提取溶劑對辣木莖葉中的植物多糖進行提取，并且對提取物進行體外功能實驗，評價其抗氧化活性，為辣木的進一步開發利用提供科學的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

辣木：購于廣州大華種植基地。

1.2 試劑

無水乙醇、苯酚、濃硫酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、1 mmol/LFeSO4溶液、3 mmol/LH2O2溶液、3 mmol/L 水楊酸溶液、Tris-HCL緩沖液、3 mmol/L鄰苯三酚溶液、10 mmol/LHCL溶液、抗壞血酸、葡萄糖標準品，等等（以上試劑均為分析純）。

1.3 儀器

新型密封式粉碎機：旭眾機電設備有限公司；LD5-2B型低速離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；RE-2000旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；HH數顯恒溫水浴鍋：金壇市金城國勝實驗儀器廠；DGX-9243BC-1型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海福瑪實驗設備有限公司；WFJ7220型可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 辣木多糖的提取工藝流程

辣木莖葉→干燥、粉碎→熱水浸提→離心→過濾→濃縮→除蛋白→醇沉→離心→干燥→粗多糖成品

1.4.2 辣木多糖提取因素的篩選

稱取1 g左右的辣木莖葉樣品粉末，根據設定的因素水平，加入一定量的水置于一定溫度的恒溫水浴鍋里浸提，提取完畢后通過4 000 r/min離心10 min，得到辣木多糖提取液。

1.4.2.1 提取條件的單因素實驗設計

本實驗分別考察浸提溫度、浸提時間、料液比三個因素對水溶劑提取多糖效果的影響。

1）不同浸提溫度對多糖提取效果的影響

采用料液比為1∶20，浸提時間為120 min，浸提溫度分別為 50、60、70、80、90 ℃下多糖的提取率。

2）不同浸提時間對多糖提取效果的影響

采用料液比為1∶20，浸提溫度為70℃，浸提時間分別為 60、90、120、150、180 min 下多糖的提取率。

3）不同料液比對多糖提取效果的影響

采用浸提溫度為70℃，浸提時間為120min，測定料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 下多糖的提取率。

1.4.2.2 辣木多糖提取條件的正交試驗

根據單因素實驗得出的結果，以浸提溫度、浸提時間、料液比為三因素，設計三因素三水平的正交試驗，設定的因素水平見表1。

表1 正交因素與水平表Table 1 orthogonal factors level table

1.4.2.3 提取工藝條件的重復性試驗

分別稱取五份辣木莖葉干粉，每份各1.00 g，在正交試驗得出的提取最優條件下提取辣木莖葉多糖，測定多糖提取率，觀察試驗工藝的可重復性。

1.4.3 多糖含量的測定以及辣木莖葉多糖產物的獲得

1.4.3.1 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。多糖提取率按式（1）計算。

1.4.3.2 辣木莖葉多糖產物的獲得

將樣品提取液于70℃下真空濃縮，濃縮至原體積的1/5～1/4，加入4℃的乙醇，使乙醇濃度為80%，注意邊加邊攪拌，保證濃縮液內部醇濃度均一，以使多糖盡可能的沉淀，將醇沉液放置于4℃條件下靜置過夜，4 000 r/min離心15 min。沉淀物放入干燥箱中50℃烘干至恒重，干品即粗多糖。

1.4.4 多糖功能性試驗方法

本研究對多糖體外抗氧化活性進行了測定。測定指標為提取物對羥自由基（·OH）的清除作用及超氧陰離子清除率。

1.4.4.1 羥自由基（·OH）的清除作用

操作方法：在25 mL的比色管中依次移取5 mL 1 mmol/L硫酸亞鐵溶液，空白管和樣品管各加入5 mL 3 mmol/L H2O2溶液，樣品管加入1 mL樣品溶液，空白管中樣品溶液用蒸餾水代替，混合均勻后用3 mmol/L水楊酸溶液定容至刻度。在（37±0.1）℃的恒溫水中反應15 min后用分光光度計在510 nm的波長下測定吸光度。若樣品溶液顏色較深，則設本底管，本底管中H2O2溶液用蒸餾水代替，按上述方法測定吸光度。空白管為 A0，樣品管為 A1，本底管為 A2。

其對·OH自由基的清除率SA（%），可根據下式（2）進行計算：

1.4.4.2 超氧陰離子清除率

操作方法：在25 mL比色管中分別加入Tris-HCl緩沖液（0.05 mol，pH=8.2）4.5 mL，3.2 m：蒸餾水，1 mL樣品溶液，空白管中樣品溶液用Tris-HCl緩沖液代替，0.3 mL 25℃下預熱過的鄰苯三酚溶液（3.0 mmol/L），本底管中鄰苯三酚溶液用10 mmol/L的HCl溶液代替；于25℃保溫20 min后，在299 nm下測定其吸光度。計算樣品對超氧自由基的清除效率。按照下列公式（3）對樣品的樣品超氧陰離子清除率進行計算：

式中：A0為不加樣品的吸光度；A1為加入樣品的吸光度；A2為本底的吸光度。

2 結果與分析

2.1 浸提溫度對多糖提取率的影響

在料液比為 1∶20（g/mL），浸提時間為 120 min，不同浸提溫度下多糖的提取率見圖1。

圖1 不同浸提溫度下多糖的提取率Fig.1 The extraction rate of polysaccharide at different extraction temperatures

由圖1可知，辣木莖葉多糖的提取率隨著溫度的升高而逐漸增加。試驗中60℃～80℃下的提取率的變化幅度較大，而80℃～90℃下的提取率變化趨于平緩。因此，在正交試驗中采用60、70、80℃的浸提溫度進行提取。

2.2 浸提時間對多糖提取率的影響

在料液比為 1∶20（g/mL），浸提溫度為 70 ℃，不同浸提時間下多糖的提取率見圖2。

圖2 不同浸提時間下多糖的提取率Fig.2 The extraction rate of polysaccharide at different extraction time

由圖2可知，辣木莖葉多糖提取率隨著浸提時間的增加而增加，提取時間達到120 min時提取率達到最大值，但當浸提時間超過120 min以后，隨著浸提時間的延長，多糖的提取率反而降低。因此，在正交試驗中采用90、120、150 min的浸提時間進行提取。

2.3 料液比對多糖提取率的影響

在浸提溫度為70℃，浸提時間為120 min，不同料液比下多糖的提取率見圖3。

圖3 不同料液比下多糖的提取率Fig.3 The extraction rate of polysaccharide at different solidliquid ratio

由圖3可知，辣木莖葉多糖的提取率隨著料液比的增加而升高，當料液比達到1∶25時多糖的提取率最高，隨后隨著料液比的增加提取率平緩下降。因此，在正交試驗中采用 1∶20、1∶25、1∶30 的料液比進行提取。

2.4 提取條件的正交試驗

2.4.1 正交試驗結果和直觀極差分析

提取條件的正交試驗結果和極差分析見表3,兩個平行試驗提取率分別以a、b表示，以Tt兩次平行試驗提取率之和，以Tr表示每次平行試驗之和，以T表示兩次平行試驗提取率總和。

由表2可知，直觀極差分析影響辣木莖葉多糖提取率的因素順序為：浸提時間＞浸提溫度＞料液比，最優提取工藝條件為A3B2C2，即浸提時間120 min，浸提溫度 80 ℃，料液比 1∶25。

2.4.2 正交試驗方差分析

試驗方差分析結果見表3。

由表3可知，方差分析得出浸提時間對多糖提取率的差異性達到了極顯著水平，但是考慮到能耗，資源利用等因素，故將浸提時間定為120 min；浸提溫度對多糖提取率的差異性達到顯著水平，故將浸提溫度定為80℃；料液比1∶20（g/mL）時較突出，但料液比對多糖提取率的差異性不顯著。

表2 正交試驗結果Table 2 Result of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.4.3 驗證試驗

由于正交試驗直觀極差分析結果（浸提溫度80℃、料液比1∶25、浸提時間120 min）與方差分析結果（浸提溫度 80 ℃、料液比 1∶20、浸提時間 120 min）不同，所以將直觀極差分析最優條件和方差分析的最優條件進行試驗比較，結果見表4和表5。

表4 直觀分析最優提取條件下多糖提取率（料液比1∶25）Table 4 Intuitive analysis of the extraction rate of polysaccharide on the optimum extraction condition（solid-liquid ratio of 1∶25）

表5 方差分析最優提取條件下多糖提取率（料液比1∶20）Table 5 Variance analysis of the extraction rate of polysaccharide on the optimum extraction condition（solid-liquid ratio of 1∶20）

檢驗不同試驗方法處理所得結果的差異顯著性，通常用t檢驗法：t0.05（8）=2.306，t0.01（8=3.355），且t＜t0.01（8），所以2種不同處理條件下提取率差異不顯著。通過變異系數對直觀和極差分析結果進行分析：變異系數是標準差相對于平均數的百分數，記為CV。變異系數同標準差一樣是衡量資料變異程度的統計計量，可以比較多次平行測定結果的相近程度。一般來說，變異系數越小，測定結果之間的接近程度越好。計算得直觀分析以及極差分析下的變異系數CV分別為0.574%、0.455%，數值均較小，充分說明直觀極差分析、方差分析所得最優條件下提取多糖試驗的重復性均較好。

2.5 多糖的功能性試驗結果

依2.4.4所示步驟考察辣木莖葉多糖提取液體外清除羥自由基以及超氧陰離子的作用，并以抗壞血酸標準溶液作為陽性對照。

2.5.1 多糖提取物對羥自由基的清除作用

2.5.1.1 多糖樣品對羥自由基的清除作用

不同濃度多糖對羥自由基清除作用見圖4。

圖4 不同濃度的辣木多糖對羥自由基的清除率的影響Fig.4 The effect of different concentrations of Moringa Oleifera Polysaccharide on the clearance rate of hydroxyl radical

由圖4的結果可知，辣木莖葉多糖對羥自由基的影響隨多糖的濃度增加而逐漸增強，多糖濃度在1 mg/mL～12 mg/mL時，對羥自由基的清除效果變化顯著，當濃度達到12 mg/mL以后，對羥自由基的清除效果趨于平緩。經計算辣木多糖對羥自由基清除作用的IC50為 7.252 8 mg/mL。

2.5.1.2 抗壞血酸清除羥自由基的作用

不同濃度抗壞血酸對羥自由基清除作用見圖5。

圖5 不同濃度抗壞血酸對羥自由基清除率的影響Fig.5 The effect of different concentrations of Ascorbic acid on the clearance rate of hydroxyl radical

由圖5的結果可知，抗壞血酸對羥自由基的清除效果與抗壞血酸的濃度成正相關。在抗壞血酸的濃度達到0.16 mg/mL之后，對羥自由基清除率的影響效果趨于平緩。經計算抗壞血酸對羥自由基清除作用的IC50為 0.046 27 mg/mL。

由2.5.1.1和2.5.1.2可知，辣木莖葉多糖具有清除羥自由基（·OH）的作用，但是清除能力明顯低于陽性對照物抗壞血酸（VC）。

2.5.2 多糖提取物對超氧陰離子的清除作用

2.5.2.1 多糖樣品清除超氧陰離子的作用

不同濃度多糖對超氧陰離子清除作用見圖6。

圖6 不同濃度辣木多糖對超氧陰離子清除率的影響Fig.6 The effect of different concentrations of Moringa Oleifera Polysaccharide on the clearance rate of superoxide anion

由圖6的結果可知，辣木莖葉多糖對超氧陰離子的清除率隨多糖的濃度增加而逐漸增強，多糖濃度在0.1 mg/mL～6 mg/mL時，對超氧陰離子的清除效果變化顯著，當濃度達到8 mg/mL以后，對超氧陰離子的清除效果趨于平緩。經計算辣木多糖對超氧陰離子清除作用的IC50為2.501 1 mg/mL。

2.5.2.2 抗壞血酸清除超氧陰離子的作用

不同濃度抗壞血酸對超氧陰離子清除作用見圖7。

由圖7的結果可知，抗壞血酸對超氧陰離子的清除效果與抗壞血酸的濃度成正相關。在抗壞血酸的濃度達到0.06 mg/mL之后，對羥自由基清除率的影響效果趨于平緩。經計算抗壞血酸對超氧陰離子清除作用的 IC50為 0.019 3 mg/mL。

圖7 不同濃度抗壞血酸對超氧陰離子清除率的影響Fig.7 The effect of different concentrations of Ascorbic acid on the clearance rate of superoxide anion

由2.5.2.1和2.5.2.2可知，辣木莖葉多糖具有清除超氧陰離子的作用，但是清除能力明顯低于陽性對照物抗壞血酸（VC）。

3 結論

根據試驗得出了水溶劑提取法提取辣木中水溶性多糖的最優工藝：浸提時間120 min、浸提溫度80℃、料液比1∶20（g/mL），在此工藝下粗多糖提取率可達到5.66%。辣木多糖具有一定的抗氧化活性，在低濃度下，對羥自由基和超氧陰離子的清除作用均效果顯著并隨多糖濃度的增加而逐漸增強，當達到一定濃度后，對二者的清除效果趨于平緩。由實驗結果計算可知，辣木多糖對羥自由基和超氧陰離子清除作用的IC50分別是7.252 8 mg/mL和2.501 1 mg/mL。

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Study on Extraction and Antioxidant Activity of Water-soluble Polysaccharides from Moringa Oleifera

LIANG Peng1，2，ZHEN Run-ying1，2
（1.Food Science Department of Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China）

Abstract：In order to explore the extraction conditions of water-soluble polysaccharide from theMoringa oleiferaleaves and antioxidant activity of it，dry powder was used as raw materials and using water as extracting solvent to extract polysaccharide fromMoringa oleifera.The extraction temperature,time and solid-liquid ratio were optimized by orthogonal experiments.Then，use methods of Salicylic acid and Pyrogallol to test antioxidant activity on polysaccharide fromMoringa oleiferain different concentrations respectively.The results showed that the extraction rate was up to 5.66%，the optimal extraction conditions was extract 120 min，using 80 ℃ hot water at a solid-liquid ratio of 1∶20 （g/mL）.The polysaccharides fromMoringa oleiferaleaf had a certain degree of antioxidant activities in vitro:scavenge OH·oand O2-in a dose-dependant manner with theIC50of 7.252 8 mg/ml and 2.501 1 mg/ml respectively.

Key words：Moringa oleifera；polysaccharide；extraction technology；antioxidant activity

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.008

梁鵬（1980—），男（漢），中級實驗師，碩士，主要從事食品加工方面的教學科研工作。

2013-03-08