響應曲面法優化超聲輔助提取化橘紅總黃酮

王雯，上官新晨，蔣艷，侯秀娟，沈勇根

（江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室江西南昌 330045）

響應曲面法優化超聲輔助提取化橘紅總黃酮

王雯，上官新晨，蔣艷，侯秀娟，沈勇根*

（江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室江西南昌 330045）

摘 要：研究了響應曲面法超聲輔助提取化橘紅中黃酮化合物的工藝。在單因素實驗的基礎上，對總黃酮提取進行優化。選擇乙醇體積分數，料液比，超聲功率，超聲溫度四因素，采用Box-behnken設計方法，研究自變量及其交互作用對總黃酮提取率的影響。利用Design Expert 6.0.1軟件對數據進行回歸分析，得到二次多項式回歸方程的預測模型。結果表明化橘紅總黃酮的最優提取條件是乙醇體積分數30%，料液比1∶100 g/mL，超聲功率150 W，超聲溫度80℃。在此條件下，獲得化橘紅黃酮最大得率為0.884%。

關鍵詞：化橘紅；響應曲面法；總黃酮；超聲輔助提取

中藥化橘紅（Exocarpium citri Grandis）又名“化州橘紅”、“化州陳皮”、“柚皮橘紅”等，是由蕓香科（Rutaceae）植物化州柚（Citrus grandis（L.）Osbeck var．tomentosa Hort.）或柚（Citrus grandis（L）Osbeck）未成熟果實或近成熟的干燥外層果皮。為較常用的中藥，臨床習慣稱化州柚為毛橘紅或者光橘紅。未成熟果實入藥可治療多種疾病[1]，如化痰理氣、健胃消食、治胸中痰滯，咳嗽氣喘、嘔吐呃逆、飲食積滯等證[2]。化橘紅黃酮類化合物的主要有效成分是柚皮苷，除此之外還有少量的野漆樹苷（rhoifolin）、新橙皮苷（neohes．peridin）、枳屬苷（poncirin）等。本實驗研究的化橘紅來源于修水縣，目前國內主要對廣州化橘紅研究較多，修水化橘紅研究鮮有報道。

超聲波提取法已經廣泛應用到植物有效成分提取中[3-4]。現普遍認為其空化效應、熱效應和機械作用是超聲技術在中藥提取中的三大種作用機制[5-6]。本實驗通過超聲波輔助提取化橘紅總黃酮，采用響應曲面設計對其提取工藝進行優化。傳統的正交試驗方法雖然能夠同時考慮幾種影響因素，尋找最佳因素水平組合，但是在實際應用中，難免會有諸多局限性，尤其在尋找因素和響應值之間的函數關系尚顯不足[7-12]，從而無法找到整個區域上因素的最佳組合和響應值的最優值[13]。響應曲面法是一種優化過程的統計學實驗方法，利用此方法可以建立連續變量曲面模型，對影響過程的因子及其交互作用進行評價，彌補了統計的單變量優化實驗的不足，并且在工業研究中得到了廣泛應用[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化橘紅：由江西華昂實業有限公司提供；蘆丁標準品（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇（分析純），石油醚（分析純），亞硝酸鈉（分析純）：天津市永大化學試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）：天津市興復精細光化研究所；氫氧化鈉（分析純）：天津市福晨光學試劑廠。

1.2 儀器與設備

723C可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋：HH-2國華電器有限公司；KQ3200DB型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BSA124S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

1.2 化橘紅總黃酮的分析測定方法

1.2.1 供試品的制備

取化橘紅粉末（過30目篩）200 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加石油醚（60-90）500 mL，加熱水浴回流提取4 h，棄去石油醚，將樣品中殘存的石油醚全部揮去，待用。

1.2.2標準曲線繪制

精密稱取120℃烘干至恒重蘆丁標準品20 mg，用體積分數為60%的乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻即得質量濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標準溶液，用移液管分別精密移取蘆丁標準液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 于 25 mL 容量瓶中，各加入質量分數為5.0%的NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min，后加入質量分數為10%的Al（NO）31.0 mL，搖勻，放置5 min，再加入質量分數為4%NaOH溶液4 mL，用體積分數60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置10 min后，分別以試劑空白和60%乙醇為參比，于510 nm波長處分別測定其吸光度，以吸光度對蘆丁質量濃度進行線性回歸，得回歸方程。

1.2.3樣品中黃酮化合物含量的測定

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

準確稱取樣品1 g于三角瓶中，超聲提取后，抽濾，移取30 mL濾液定容至100 mL容量瓶中，搖勻。移取10 mL于25 mL容量瓶中，用1.2.1的方法測定其在510 nm的吸光度，然后按照下式計算化紅中黃酮類化合物的得率。

黃酮得率（%）=C×a×V／w×100%

式中：C為提取液黃酮物質的質量濃度，（mg/mL）；a為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；w為化橘紅粉末質量。

1.3方法

1.3.1單因素實驗

影響超聲的因素很多，在預實驗中對超聲溫度、超聲時間、超聲功率、料液比、乙醇的體積分數和超聲提取次數進行考察。按照1.2.3的方法提取化橘紅總黃酮，并計算得率。

1.3.2 響應曲面法試驗設計

在單因素試驗的基礎上選擇對響應值（總黃酮得率）有顯著影響的因素：超聲溫度，超聲功率，料液比，乙醇濃度，其它條件為單因素試驗的最佳條件，即超聲時間50 min，提取次數1次，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平試驗方案，利用Design Expert軟件對試驗數據進行回歸分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲溫度對提取的影響

超聲溫度對提取的影響見圖2。

隨著提取溫度的升高，黃酮得率增加，在70℃時達到最大值，而在80℃時黃酮的得率下降，溫度過高接近乙醇的沸點，可能會影響黃酮類物質的溶出量。這可能是由于高溫會引起細胞膜結構變化，從而使黃酮容易轉移到溶液中，但過高的溫度又會引起黃酮物質結構發生變化，破壞黃酮物質[15]。

圖2 超聲溫度對黃酮得率的影響Fig.2 Effect the ultrasonic temperature on extraction rate of total flavones

2.1.2 超聲時間對提取的影響

超聲時間對提取的影響見圖3。

圖3 超聲時間對黃酮得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate of total flavones

超聲時間在10 min～50 min時，黃酮得率隨著時間的延長緩慢上升，在50 min的時候黃酮的得率最大，當時間在50 min～70 min時黃酮得率出現降低的趨勢，由于有效由于有效成分濃度差是超聲提取的主要推動力，在提取初期，有效成分濃度差大，因此提取速率快，提取率增加明顯，隨著提取時間的延長，溶劑中有效成分濃度逐漸增大，和固相中的濃度差逐漸變小，也就是推動力變小，所以提取速率慢慢減慢[16]。當時間從70 min～90 min時，隨著超聲時間的延長，可能溶出其它的雜質，影響黃酮得率。

2.1.3 超聲功率對提取的影響

超聲功率對提取的影響見圖4。

隨著超聲功率的增大，黃酮得率也呈上升趨勢，這是因為超聲功率的增加，提取的推動力增大，使得被萃取出來的黃酮化合物的量也隨之增多。對一定頻率和一定發射面的超聲來說，功率增大，聲強隨之增大。如果聲強增大，聲壓幅值以及液體中相應負壓力亦增大，造成空化泡的半徑逐漸增大至極限，空化泡崩潰所需的時間將變得更短，也就是說單位時間內超聲產生的空化事件增多，從而有利于植物藥有效成分提取率的提高[16]。

圖4 超聲功率對黃酮得率的影響Fig.4 Effect of the ultrasonic power on extraction rate of total flavones

2.1.4 料液比對提取的影響

料液比對提取的影響見圖5。

圖5 料液比對黃酮得率的影響Fig.5 Effect of liquid to solid ratio on extraction rate of total flavones

乙醇用量的增加有助于黃酮類化合物的浸出，由于化紅粉末與提取液接觸面的濃度增大，溶劑中溶質的濃度差和溶劑能夠溶解的物質的量在不斷增大所致，溶劑用量少，不容易提取完全，但料液比過大，黃酮得率隨之下降，而且也會導致提取成本提高，給后續的濃縮和純化工作帶來壓力。所得料液比的趨勢圖與超聲提取苦蕎總黃酮和火麻仁總黃酮的趨勢圖相似[17-18]。

2.1.5 乙醇體積分數對提取的影響

乙醇體積分數對提取的影響見圖6。

由圖6可知，乙醇體積分數對黃酮得率影響較大，不同體積分數的乙醇極性不同，根據相似相溶原理，當體積分數為40%時，黃酮得率最高，這可能是因為大量的水可以有效膨脹化橘紅組織，增大溶質與溶劑接觸面積，降低溶劑的黏度，加速溶質擴散，但是當乙醇體積分數過大時，沸點下降，導致揮發增大，同時一些醇溶性雜質、色素、親脂性的成分溶出量增加，與黃酮化合物競爭，從而導致黃酮化合物得率下降。所得結論的趨勢圖與朱金霞[19]提取苦豆子黃酮和田英娟[20]超聲提取橄欖總黃酮相近。

圖6 乙醇體積分數對黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavones

2.1.6 提取次數對提取的影響

提取次數對提取的影響見圖7。

圖7 提取次數對黃酮得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of total flavones

圖7表明，提取1次與提取2次之間差異極顯著，提取2次和3次之間差異不顯著。提取1次時，化橘紅總黃酮得率明顯高于2次、3次，說明原料經兩次提取其中的黃酮物質已經大部分被提出來[21]，因此最佳提取效果為1次。

2.2 響應曲面試驗結果分析

響應曲面法的試驗設計方案見表1和實驗結果見表2。

表1 Box-Behnken響應曲面設計及結果Table 1 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results

續表1 Box-Behnken響應曲面設計及結果Continue table 1 Box-Behnken response surface design matrix and experimental results

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Variance analysis for the established regression model

對表試驗數據進行多元回歸擬合，得到響應曲面二次多元回歸模型方程：

式中：Y 代表化橘紅總黃酮得率，A、B、C、D、分別代表超聲溫度，超聲功率，料液比，乙醇濃度。

對該模型進行方差分析，結果見表2。由表2可知，模型具有高度顯著性（P＜0.000 1），失擬項（P=0.382 8＞0.05）不顯著，模型的復相關系數R2=0.920 4，說明該模型能解釋92.04%的響應值變化，即該模型與實際實驗擬合程度良好，實驗誤差小，可以用此模型對實驗進行分析和預測。由回歸模型的系數顯著性檢驗可知，模型的一次項A、B、C對化橘紅中黃酮提取的線性效應極顯著，二次項B2、C2、D2對化橘紅中黃酮提取的線性效應極顯著，二次項AD對化橘紅中黃酮提取的線性效應顯著。因此，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以用其確定最佳提取工藝條件。

圖8～圖11是各因子交互作用的響應曲面的3D分析圖。

圖8 超聲溫度與料液比對黃酮得率影響的曲面圖Fig.8 Surface chart of response on effect the ultrasonic temperature and liquid to solid ratio on the flavonoid yield

圖9 超聲溫度與乙醇體積分數對黃酮得率影響的曲面圖Fig.9 Surface chart of response on effect the ultrasonic temperature and ethanol concentration on the flavonoid yield

圖10 超聲功率與乙醇濃度對黃酮得率影響的曲面圖Fig.10 Surface chart of response on effect the ultrasonic power and ethanol concentration on the flavonoid yield

圖11 料液比與乙醇濃度對黃酮得率影響的曲面圖Fig.11 Surface chart of response on effect liquid to solid ratio and ethanol concentration on the flavonoid yield

圖8表明，超聲溫度升高，黃酮得率增加，當料液比達到1∶95 g/mL左右，黃酮的得率會略有降低。圖9表明，超聲溫度與乙醇體積分數之間交互作用不明顯，提取溫度不變，化橘紅總黃酮得率隨乙醇體積分數的增大而增大，達到峰值后，總黃酮的得率隨著乙醇濃度增大而減小。圖10表明，黃酮得率隨超聲功率增加呈上升趨勢，黃酮得率與乙醇體積分數具有二次拋物線關系。乙醇體積分數在30%～40%附近出現峰值，根據相似相溶原理可知，化橘紅黃酮極性與此范圍乙醇溶液的極性相當。圖11表明，乙醇體積分數和料液比交互作用明顯，化橘紅總黃酮得率隨著乙醇體積分數的增加而增大，在低乙醇體積分數和高乙醇體積分數時，黃酮得率較低，料液比的增加能降低提取溶液中黃酮的含量，從而增加料液比兩相黃酮的濃度梯度，進而提高化橘紅黃酮溶出的速度，最終提高得率[22]，但是料液比過高，也會降低黃酮得率。

在選取的各因素范圍內，根據回歸模型通過Design-expert軟件分析得到化橘紅總黃酮的最佳提取條件是超聲溫度79.37℃，超聲功率149.02 W，料液比96.58 g/mL，乙醇濃度31.21%，總黃酮得率的預測值為0.903 8%。為了驗證響應面法的可行性，采用修正的最佳提取條件：超聲溫度79℃，超聲功率150 W，料液比100 g/mL，乙醇濃度30%，進行化橘紅黃酮驗證實驗，重復三次，求平均值，得到化橘紅總黃酮的得率為0.884%，與預測值基本一致，驗證了實驗模型的可行性，說明響應曲面法優化化橘紅黃酮提取條件是可行的，所得的黃酮提取條件具有實際應用價值。

3 結論

在單因素試驗的基礎上通過響應曲面法建立了一個超聲提取化橘紅總黃酮二次項回歸模型，經檢驗證明合理可靠。獲得超聲提取化橘紅總黃酮的最佳工藝條件為超聲溫度79.37℃，超聲功率149.02 W，料液比96.58 mL/g，乙醇濃度31.21%，化橘紅總黃酮得率為0.903 8%。經驗證結果穩定，是一種較優的提取化橘紅黃酮的工藝方法，為化橘紅黃酮的開發利用提供理論參考。

：

[1]李潤唐,張映南,李映志,等.化橘紅研究進展[J].廣東林業科技，2008(2):82-85

[2]中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京:化學工業出版社,2005:149

[3]Vilkhu R,Mawson L,Simons D,et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry-A review[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2008,9(2):161-169

[4]Wang J,Sun B,Cao Y,Tian Y,et al.Optimisation of ultrasoundassisted extraction of phenolic compounds from wheat bran[J].Food Chemistry,2008,106(2):804-810

[5]胡愛軍,楊日福,丘泰球,等.超聲強化超臨界流體萃取裝置的設計及應用[J].聲學技術，2005,24(3):178-180

[6]賁永光,丘泰球,閆杰.雙頻超聲強化從海金沙中提取黃酮的實驗研究[J].聲學技術,2006,25(3):209-213

[7]LIU Shucheng,YANG Feng,ZHANG Chaohua,et al.Optimization of process parameters for supercritical carbon dioxide extraction of Passiflora seed oil by response surface methodology[J].The Journal of Supercritical Fluids,2009,48(1):9-14

[8]王明艷,楊凡,李燕,等.響應面法優化百部多糖提取條件研究[J].食品科學,2009,30(6):80-83

[9]許暉,孫蘭萍,張斌,等.響應面法優化花生殼黃酮提取工藝的研究[J].中國糧油學報,2009,24(1):107-111

[10]LIANG R J.Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(4):858-861

[11]ALESSANDRA L,ELIANA S,JOSE A.Response surface analysis of extract yield and flavour intensity of Brazilian cherry(Eugenia uniflora L.)obtained by supercritical carbon dioxide extraction[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2009,10(2):189-194

[12]周燕芳,丁利君.超聲波輔助提取艾葉黃酮的工藝研究[J].食品與機械,2006,22(4):39-41

[13]劉春泉,宋江峰,李大婧,等.響應曲面法優選靈芝子實體多糖的提取工藝[J].江蘇農業學報，2007，23(3):239-243

[14]Bahadir K.Response surface methodology(RSM)analysis of photoinduced decoloration of toludine blue[J].Chemical Engineering Journal,2008，136(1):25-30

[15]郭輝,羅宇倩,章華偉,等.響應曲面法優化超聲輔助提取荷葉黃酮工藝研究[J].中國食品學報，2011，11(1):119-125

[16]賁永光,丘泰球,李康,等.超聲強化溶劑提取車前草中總黃酮的研究[J].聲學技術，2009，28(2):133-136

[17]王軍,王敏,宋旭輝,等.響應曲面法優化苦蕎麩皮總黃酮的提取工藝[J].西北農林科技大學學報，2006，34(12):189-194

[18]趙翾,李紅良,張惠妹.響應面法優化火麻仁黃酮提取工藝[J].食品科學,2011,23(2):127-131

[19]朱金霞,郭生虎,鄭國保.超聲波法優選苦豆子中總黃酮的提取工藝研究[J].中國野生植物資源,2010,29(5):35-38

[20]田應娟,朱良,陳健,等.超聲強化提取橄欖黃酮類物質及其抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2011，32(1):17-22

[21]許瑞波,趙躍強,魯升麗,等.山楂葉黃酮的超聲提取、精制及抗氧化性研究[J].食品研究與開發,2007,128(4):64-69

[22]許暉,孫蘭萍,張斌,等.響應面法優化花生殼黃酮提取工藝的研究[J].中國糧油學報,2009,24(1):106-110

Ultrasound-assisted Extraction of Total Flavonoids From Exocarpium Citri Grandis with Response Surface Methodology

WANG Wen，SHANGGUAN Xin-chen，JIANG Yan，HOU Xiu-juan，SHEN Yong-gen*
（Jiangxi Key Laboratory of Natural Product and Functional Food，College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

Abstract：The ultrasonic-assisted extraction process of flavonoids from Exocarpium citri Gandis was studied.Based on the experiment of single factor to optimize extraction yield of total flavonoids.The effects of the ethanol concentration，ratio of the liquid to solid，the ultrasonic power and the ultrasonic temperature were studied with Box-behnken design and their interactive effect on the extraction rate of total flavonoids were also investigated.The predictive model of polynomial quadratic equation was analysed by Design Expert software （6.0.1.）.The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids from Exocarpium citri Gandis were ethanol concentration 30%，ratio of the liquid to solid 1∶100 g/mL，the ultrasonic power 150 W，extraction temperature 80℃.Under these conditions，the predicted value of extraction yield of total flavonoids was 0.884%.

Key words：ExocarpiumcitriGrandis；responsesurfacemethodology；totalflavonoids；ultrasonic-assisted extraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.14.009

江西省教育廳“修水化橘紅止咳化痰功效成分研究”項目(GJJ11404)；修水華昂實業有限公司橫向課題

王雯（1985—），女（漢），研究生，研究方向：食品科學。

沈勇根（1971—），男，副教授，碩士，研究方向：食品科學。

2012-11-10