食源性致病菌焦磷酸通用引物測序方法的建立

趙新，王永，蘭青闊，陳銳，朱珠，余景會，李歐靜，郭永澤

（天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381）

食品安全是人們近年來較為關注的話題，而食源性致病菌是誘發食品安全問題的重大因素之一。因而，建立一種準確快速的檢測致病菌的方法一直是研究的熱點[1-2]。傳統的鑒定方法繁瑣費時，將細菌分離培養與PCR及雜交探針、基因芯片等技術手段相結合[3-4]，具有耗時短、重復性好等優點，但無法得到目的基因序列信息，存在假陽性的偏差，且多需進行凝膠電泳。

焦磷酸測序（Pyrosequencing）技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無需進行電泳，DNA片段也無需熒光標記，從而能夠真正達到快速、準確的鑒定病原微生物的目的，且操作極為簡便[5]。

選取食源性致病菌中較為常見和典型的4種致病菌（沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌），利用16SrRNA高度保守區序列和可變區序列設計一組通用引物，同時檢測和鑒定4種致病菌，經驗證得到與國標方法一致的檢測結果，可用于食源性致病菌的快速檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株

乙型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50094、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50433、鼠傷寒沙門氏菌CMCC（B）50013、痢疾志賀氏菌 CMCC（B）51592、福氏志賀氏菌 CMCC（B）51571、鮑氏志賀氏菌 ATCC 9207、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、單增李斯特氏菌CMCC（B）54002共8株常見的危害人和動物的食源性致病菌，均為本室購買標準菌株。菌株復蘇后接種于相應的增菌培養基中過夜培養。

1.1.2 主要試劑和儀器

特異性擴增引物和測序引物：上海生工合成；Go－TaqRMaster Mix溶液：Promega公司；Sepharose Bead、binding buffer、Annealing Buffer、底物、酶和 A、C、G、T四種堿基：Biotage公司；定量遺傳分析儀：基因有限公司；PCR擴增儀：ABI Veriti及ABi 2720；凝膠電泳設備：BIO－R AD Power200；凝膠成像系統：SYNGENE 公司產品。

1.2方法

1.2.1 引物的設計與合成

通過基因庫數據檢索網站 NCBI、KEGG和ClustalW程序分別對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的16SrR NA保守序列進行同源性分析，尋找適合的通用測序序列[6]；再應用焦磷酸測序儀配套專業軟件設計適合沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的焦磷酸測序通用擴增和測序引物。

1.2.2 細菌DNA的提取

取選擇性增菌后菌液100 μL，100℃煮菌10 min，立即－20℃，冰浴10 min，微型離心機離心 2 min～3 min，上清極為細菌DNA模板，備用。

1.2.3 PCR反應體系及擴增程序

擴增反應的總體積為50 μL，其各種成分分別為：2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用滅菌去離子水補齊至 50 μL；反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸 30 s，循環40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 測序單鏈的制備

將3 μL鏈親和素包被的磁珠和47 μL的binding buffer混勻，然后加入到 50 μL的 PCR產物中，1 300 r/min～1 400 r/min，室溫振蕩混勻 10 min～15 min；在PSQ Low反應板中預先加入40 μL含有0.3 μmol/L測序引物的Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中，進行單鏈制備，備用。

1.2.5 測序反應體系

測序反應的總體積約為150 μL，其中各種成分分別為：PCR產物 50 μL，Sepharose Beads 3 μL，Binding Buffer 47 μL （10 mmol/L Tris－HCl，2 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1%Tween20，pH7.6），10 μmol/L 測序引物 1.2 μL，Annealing Buffer 38.8 μL （20 mmol/L Tris－AC，2 mmol/L MgAC2，pH7.6），再根據軟件提示在試劑艙相對應位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。

1.2.6 測序反應程序

采用SQA模式，按照CGCGACGCTAGCGTCT的堿基排列順序進行測序。

1.2.7 添加靈敏度對比試驗

將四種致病菌菌液分別進行10倍梯度稀釋，篩選出 105、104、103、102、10、1、0 CFU/mL 的菌懸液，各取1 mL添加于24 mL無菌牛奶樣本中，備用。將上述一系列25 mL牛奶樣本按照傳統國標方法增菌，并進行后期生化鑒定[7－10]；同時將增菌后的典型菌落，用煮菌法提取模板DNA，用于PCR擴增而后進行焦磷酸測序。

2 結果

2.1 引物設計結果

通過NCBI、KEGG等數據庫的檢索，獲得沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌的相關序列，并通過ClustalW程序進行同源性分析，應用焦磷酸測序儀配套專業軟件分別對四種菌的16SrR NA保守序列進行同源性分析，通過序列比對發現四種菌的16SrR NA序列同源性適度，且又存在差異，適合設計焦磷酸測序通用擴增引物和測序引物，引物設計情況見表1。

表1 通用擴增引物和測序引物序列Table 1 PCR amplification primers and sequencing primers

2.2 PCR反應擴增結果

擴增反應的總體積為50 μL，其各種成分分別為：2×GoTaqRMaster Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，用滅菌去離子水補齊至 50 μL；反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環40次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。取PCR產物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳，均能擴增出目的片段大小的單一條帶，結果見圖1。

圖1 四種食源性致病菌通用引物PCR擴增產物的電泳分析圖譜Fig.1 Result of PCR amplification of Four Kinds of Food-borne Pathogenic Bacteria

2.3 焦磷酸測序結果

根據對四種食源性致病菌16SrRNA序列分析，設計通用擴增引物和測序引物，四種食源性致病菌均可用一組16SrRNA擴增引物得到高濃度的PCR產物，再通過同一條測序引物分析四種食源性致病菌的差異位點，已知位點差異分別為：沙門氏菌CGC ACG CAG GCG GTCT；金黃色葡萄球菌CGCGCGTAGGCGGTTT；志賀氏菌CGCACGCAGGCGGTTT；單增李斯特菌CGCGCG CAGGCGGTCT，經本實驗方法焦磷酸測序后結果與已知位點差異完全吻合，焦磷酸測序結果見圖2～圖5，4種食源性致病菌位點差異模擬圖見圖6～圖9。

圖2 沙門氏菌擴增產物測序結果圖Fig.2 Result of Pyrosequencing of Salmonellla spp

圖3 金黃色葡萄球菌擴增產物測序結果圖Fig.3 Result of Pyrosequencing of Staphylococcus aureus

圖4 志賀氏菌擴增產物測序結果圖Fig.4 Result of Pyrosequencing of Shigella spp

圖5 單核細胞增生李斯特菌擴增產物測序結果圖Fig.5 Result of Pyrosequencing of Listeria monocytogenes

圖6 沙門氏菌位點差異模擬圖Fig.6 Simulation chart of site difference of Salmonellla spp

圖7 金黃色葡萄球菌位點差異模擬圖Fig.7 Simulation chart of site difference of Staphylococcus aureus

圖8 志賀氏菌位點差異模擬圖Fig.8 Simulation chart of site difference of Shigella spp

圖9 單核細胞增生李斯特菌位點差異模擬圖Fig.9 Simulation chart of site difference of Listeria monocytogenes

2.4 添加靈敏度對比試驗結果

四種食源性致病菌的傳統國標方法鑒定結果為105、104、103、102、10 CFU/mL 的添加樣品均檢出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加樣品未檢出；焦磷酸測序方法測序結果為 105、104、103、102、10 CFU/mL 的添加樣品均檢出，1 CFU/mL和0 CFU/mL的添加樣品未檢出。由此可見，焦磷酸測序方法與傳統國標的生化鑒定方法完全可達到相同的靈敏度，但省去了后期繁瑣而費時的生化鑒定步驟，結果見表2。

表2 焦磷酸測序及國家標準方法檢測靈敏度比較結果Table 2 Comparative sensitivities of Pyrosequencing and National standard method

3 結論

傳統國標法的生化培養一直是食源性致病菌檢測方法的金標準，但隨著食品安全問題各種應急預案的不斷發生，生化培養的較長時間已逐漸造成應急預案在最短的時間內判讀和控制的困擾，因此各種快速檢測技術不斷涌現，免疫學法、測試片法、PCR方法、LAMP技術等等，而這些快檢技術都存在著自身相應的不足，比如，免疫學方法假陰性高，人為要求操作水平影響較大；測試片儲存時間極短，一旦開封剩余測試片儲存時間最多兩個月，且不易保存；PCR方法存在氣溶膠污染；LAMP方法，易出現假陰性、假陽性的結果，且結果不易穩定，那么無疑測序技術是目前相關技術中最本質的從基因序列水平判讀結果的方法，可靠性大大增強。

焦磷酸測序技術較傳統的Sanger金標法具有其獨特的優勢，焦磷酸測序技術可以應用于短片端序列的判讀，可直接判讀測定引物后面的模板序列，無需電泳，也無需熒光染色，操作簡便，成本相對較低，且一次可完成96個樣本的檢測，通量高；檢測實時快速，20 bp左右的序列，僅需10多分鐘即可完成。

不同細菌的16SrRNA由于其基因既具有高度保守序列，又具有各自特有的多變序列，因此被公認為細菌種屬水平檢測的專屬基因。利用這一特性，近年來也建立了一些能同時檢測多種細菌的PCR方法，如PCR-限制性內切酶片段分析[11]，PCR-反向斑點雜交[12-13]等，但這些方法操作復雜，分析繁瑣，不適用于應急預案快速準確的判讀。

本研究通過構建一組通用引物，同時得到四種食源性致病菌的高濃度PCR單一產物，利用測序引物，通過四種菌可變區2個～3個堿基位點差異，判讀細菌不同種屬。測序結果與傳統國標法比較，得到了100%的吻合率，且具備較高的靈敏度。由此證明本研究所建立的焦磷酸測序方法適合于食源性致病菌的快速檢測，且將微生物檢測基于分子水平的研究，實現了在基因水平上對致病微生物進行最本質的序列分析及鑒定[14-15]。

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