黃酒發酵動力學研究

彭金龍 毛 健， 姬中偉 黃桂東 謝廣發 鄒慧君

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000）

黃酒為世界三大古酒之一，源于中國，唯中國有之，因其富含糖類、氨基酸、維生素、蛋白質、多酚、微量元素、酯類等成份，且易被人體消化吸收，被譽為“液體蛋糕”［1－3］。千百年來，黃酒主要是采用傳統的陶缸、陶壇作為發酵容器進行的手工作坊式生產［4，5］。但是傳統的依靠自然氣候條件發酵生產黃酒的過程，很難控制，從而造成了黃酒產量增長速度緩慢、各批次品質差異較大，這使得機械化大罐生產黃酒成為黃酒生產工藝革新的必然趨勢［6］，然而大罐生產黃酒的關鍵技術還未被完全突破。

發酵動力學是對試驗過程進行定量分析，對試驗指標進行較為準確的預測［7］，對發酵過程放大及從分批發酵過渡到流加發酵、連續發酵有著重要指導作用的過程，目前在葡萄酒［8］、醋［9］、秈米酒［10］、櫻桃果酒［11］等生產中已得到了廣泛應用。本試驗基于對黃酒發酵過程中的化學反應、菌體的新陳代謝機理等的研究，建立黃酒發酵的動力學方程，這將有利于更準確的掌握、了解黃酒發酵過程的各重要參數，對實現黃酒發酵自動化具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糯米：購于江蘇無錫；

麥曲：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；

活性干酵母：安琪酵母公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：FA204N型，上海精密科學儀器有限公司；

離心機：4K15型，德國Sigma公司；

恒溫水浴鍋：HH－S2系列，江蘇金壇環宇科學儀器廠；

分光光度計：722S型，上海精密科學儀器有限公司；

精密pH計：PHS－3C型，上海精密科學儀器有限公司；

酒度計：浙江余姚黃家埠玻璃儀表廠；

電熱鼓風干燥箱：HG101－2型，南京實驗儀器廠；

全自動控制黃酒專用發酵罐：BIOTECH 10L型，上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 黃酒的釀造工藝

按照機械化釀造黃酒的工藝釀造黃酒［12］，發酵罐中投料量按照5L發酵罐配比投料（10L發酵罐投料相對5L放大1倍）：糯米投料量1kg（室溫浸米24h后蒸飯），釀酒用活性干酵母2g（用2g蔗糖，100mL蒸餾水，40℃活化40min，確保初始酵母菌數的數量為107個／g），加水1.5L（包括700mL米漿水），曲170g（原料米的17%）。前酵溫度為30℃，后酵溫度為15℃。前酵每隔12h取1次樣，后酵每隔24h取1次樣，測定殘糖濃度、酒精度和菌體生物量。

1.4 檢測方法

向發酵罐中沖入無菌空氣將黃酒醪液混勻后，從發酵罐中取250mL醪液，測定殘糖濃度、酒精度和菌體生物量。按照林巧等所述的細胞干重法［11］測定菌體生物量：10mL黃酒醪液3 000r／min離心3min后，上層液體再1 000r／min離心10min，倒去上清液待用，沉淀物（菌體）于105℃烘干至恒重后稱量；另取240mL黃酒發酵醪液，用雙層紗布過濾后，濾液3 000r／min離心5min，將離心后的上清液按照GB／T 13662——2008［13］中所述的亞鐵氰化鉀滴定法和蒸餾法測定殘糖濃度和酒精度。

1.5 數據處理

使用 Matlab，結合csape、nlinfit、ppval、fnder軟件，根據試驗所得數據，對酵母生長動力學方程、酒精生成動力學方程和底物糖消耗動力學方程進行非線性回歸，求解出模型的參數。

2 結果與分析

2.1 黃酒發酵過程主要物質變化曲線

將釀造黃酒所有原輔料投入到10L發酵罐中，按照機械化釀造黃酒工藝釀造黃酒，測定殘糖濃度、酒精度和菌體生長量，所得黃酒發酵過程主要物質變化曲線見圖1。

圖1 黃酒發酵過程主要物質變化曲線Figure 1 Metabolic curves of fermentation process of Chinese rice wine

由圖1可知，酵母菌的生長速度很快，接種后不久便開始進入對數生長期。當酵母菌發酵至4d后菌體生長進入了穩定期，此時菌體生物量達到最高值20.34g／L；7d后，黃酒發酵液中菌體細胞進入衰亡期，細胞生長環境惡化，活細胞死亡率增加，細胞濃度迅速降低。對于產物酒精，其產量在前5d內快速增長；5d后黃酒發酵進入后發酵期，發酵溫度降為15℃，酵母產酒精也變得緩慢。體系中的總糖因維持菌體生長，形成產物，維持細胞呼吸新陳代謝作用而不斷消耗，因此不斷減小。

2.2 菌體生長動力學模型的建立

由于黃酒生產周期長，菌體生長可明顯分為前期（生長期及穩定期）和后期（衰亡期）兩個階段，因此采用分段函數對菌體生長狀況進行描述。

（1）發酵前期：Logistic模型是一個典型的S形曲線方程，廣泛應用于發酵的細胞生長過程［14］，能夠較好地反映發酵過程中由于細胞濃度增加對其自身所產生的抑制效應。根據黃酒發酵特點，選用Logistic模型描述菌體細胞前期的生長情況，求解各參數：

式中：

X—— 菌體濃度，g／kg·醪液；

μm—— 最大比生長速率，h－1；

Xm—— 最大菌體濃度，g／L。

對式（1）兩邊積分得式（2）：

根據發酵過程中的試驗數據，X0＝7.37，Xm＝20.34及估算值μm＝0.135，結合Logistic模型，使用Ode45，對微分方程（2）擬合求解得到X0＝7.00，Xm＝20.29及μm＝0.277，并代入方程（2），得：

（2）發酵7d后，菌體細胞進入衰亡期，在衰亡期細胞生長環境惡化，活細胞死亡速率增加，細胞濃度迅速降低，在此不作考慮。

2.3 酒精生成模型

黃酒發酵過程中，酒精是酵母細胞代謝的產物，基于此理論，酒精的形成模型應該與菌體的質量濃度相關。由此，可采用較為通用的由 Luedeking R 和 Piret EL［15，16］于1959年所提出的數學模型：

式中：

α——生長相關系數；

β——非生長相關系數；

p—— 產物濃度，g／L；

對于酒精生成過程是與酵母生長相關的過程，因此黃酒發酵過程顯然屬于產物部分偶聯型（α≠0，β≠0）的相關模型。式（4）兩邊積分得式（5）：

通過軟件擬合得到生長相關系數α＝66.10，代入式（5）得到產物生成動力學模型公式：

2.4 底物糖消耗模型

黃酒發酵過程中，底物消耗模型應從底物消耗的3個部分來考慮：形成產物，供給菌體生長，維持細胞呼吸新陳代謝作用［17］。基于此原理，黃酒發酵過程中底物糖消耗模型的建立形式為：

式中：

Yx／s—— 菌體對底物的得率系數；

Yp／s—— 酒精對底物的得率系數；

m—— 維持系數，h－1；

S—— 底物濃度，g／L；

底物在細胞內合成產物的模型取決于產物的生成是否與能量代謝過程相偶聯。當產物的生成是以產能途徑進行時，則由于細胞生長和維持能，生成產物則是不可避免的，此時無單獨底物流入細胞用于生成產物，而所生成產物所消耗的底物來自于用于生長和維持能的底物，并且消耗于維持能的底物對細胞生長無作用。對于酵母發酵產酒精這一生理過程，生產酒精所消耗的底物來自于細胞生長維持能的底物，此時產物的生成直接與能量的生產相聯系，因此底物的消耗速率方程不包括單獨的產物生成項，可將原方程化簡為：

上式兩邊積分得：

黃酒發酵過程中，以殘糖含量作為底物消耗指標，通過擬合得到模型參數初始底物濃度S＝107.7，底物的細胞生長得率系數Yx／s＝0.066 9、維持系數m ＝0.193，代入上式得到底物消耗模型為：

2.5 模型驗證

按照機械化釀造黃酒的工藝條件，進行黃酒分批發酵的重復試驗，將分批發酵所得的實驗值與上述參數代入后得到的動力學模型預測的理論值進行比較，結果見表1。比較發現：用動力學模型擬合分批發酵過程除極個別點外，大部分數據點的誤差均小于10%，發酵終點的糖含量誤差很大，可能是由亞鐵氰化鉀滴定法帶來的誤差，而且殘糖濃度基本接近于零，可舍去該點。菌體生長、產物形成和底物消耗的平均相對偏差分別為8.88%、3.45%和1.58%，表明所擬合的動力學模型較好地反映了實際的發酵過程。

表1 動力學模型計算值與實驗值的比較Table 1 Error proof of Dynamics model of pullulan fermentation

3 結論

本研究分別采用Logistic方程與Luedeking R經驗方程描述酵母的生長與酒精合成、底物消耗過程，建立了黃酒發酵過程中菌體生長模型、酒精生成模型和底物糖消耗模型，并對模型加以驗證。

通過對黃酒發酵動力學的研究，進一步了解了黃酒發酵過程中微生物生理特征，發酵過程中底物消耗和產物形成的規律，以及各參數之間的關系，為黃酒發酵過程工藝控制和黃酒大罐發酵的設計提供了理論基礎。

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