桑椹酒香氣成分的HS－SPME－GC－MS分析

衛(wèi)春會(huì) 邊名鴻 黃治國(guó)

羅惠波1，2 王 毅1 楊曉東1

（1.四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 自貢 643000）

桑椹酒是一種新興的果酒，是以新鮮桑椹、干桑椹或桑椹汁為原料，利用酵母經(jīng)過酒精發(fā)酵、陳釀等過程釀制而成，具有典型的桑椹香味和酒香，口味爽口。經(jīng)發(fā)酵的桑椹酒營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有許多保健功能。飲用后，不但可以改善女性手腳冰冷的毛病，更有補(bǔ)血、強(qiáng)身、益肝、補(bǔ)腎、明目等功效，可稱之為水果酒中的極品［1，2］。

頂空固相微萃取是一種全新概念的樣品預(yù)處理濃縮技術(shù)，它克服了傳統(tǒng)提取方法的缺陷，具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性及線性好、樣品處理時(shí)間短、分析樣品用量少、無需有機(jī)溶劑和綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)［3－5］。頂空固相微萃取－氣質(zhì)聯(lián)用法（HS－SPME－GC－MS）已廣泛應(yīng)用于櫻桃酒、葡萄酒、蘋果酒、黃酒等酒類的揮發(fā)成分的研究［6－9］，但對(duì)桑椹發(fā)酵型果酒香氣成分頂空固相微萃取的方法進(jìn)行優(yōu)化尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)頂空固相微萃取法提取桑椹果酒中香氣成分的條件進(jìn)行了優(yōu)化，使用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析，為進(jìn)一步完善桑椹酒的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

桑椹酒：釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：6890N－5975B型，美國(guó)Agilent科技有限公司；

頂空固相微萃取、SPME手動(dòng)進(jìn)樣柄和萃取頭50／30μmDVB／CAR／PDMS：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

恒溫磁力攪拌器：HJ－8B型，金潭市正基儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

參照文獻(xiàn)［10］，于15mL樣品瓶中加入桑椹酒、NaCl和磁力轉(zhuǎn)子，蓋好瓶蓋后，迅速置于磁力攪拌加熱臺(tái)上，轉(zhuǎn)速為200r／min條件下，加熱攪拌。然后將已經(jīng)熱解析過的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，萃取頭距離液面1cm處，然后將已吸附香味物質(zhì)的萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口，230℃條件下解析3min。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.1 萃取條件的優(yōu)化

（1）NaCl濃度的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶?jī)?nèi)，加入不同質(zhì)量的 NaCl（0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30g／mL），萃取溫度40 ℃，萃取和平衡時(shí)間均為30min。萃取完成后用于GC－MS分析。

（2）萃取溫度的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶?jī)?nèi)，按照0.2g／mL量加入NaCl，萃取和平衡時(shí)間均為30min，萃取溫度分別為20，25，30，35，40，45，50℃。萃取完成后用于GC－MS分析。

（3）萃取時(shí)間的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶?jī)?nèi)，按照0.2g／mL量加入 NaCl，萃取溫度40℃，平衡時(shí)間30min，萃取時(shí)間分別為5，10，20，30，40，50，60min。萃取完成后用于GC－MS分析。

（4）平衡時(shí)間的優(yōu)化：取5mL桑椹酒樣品于樣品瓶?jī)?nèi)，按照0.2g／mL量加入 NaCl，萃取溫度40℃，萃取時(shí)間30min，平衡時(shí)間分別為5，10，20，30，40，50，60min。萃取完成后用于GC－MS分析。

1.3.2 氣相色譜－質(zhì)譜條件

（1）色譜條件：DB－WAX 60.0m×0.25mm×0.25μm毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度230℃；分流比30∶1；程序升溫：60℃保持3min，以5℃／min升到200℃，再以10℃／min升到230℃保持1min；載氣：99.999%氦氣，載氣流速：1mL／min。

（2）質(zhì)譜條件：電離電壓70eV，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，電離方式為EI，質(zhì)量掃描范圍為20～500amu，溶劑延遲3min。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)桑椹酒進(jìn)行分析，以出峰個(gè)數(shù)、峰面積以及香味物質(zhì)的數(shù)目3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，同時(shí)與NIST譜庫(kù)對(duì)比，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素條件優(yōu)化結(jié)果與分析

2.1.1 NaCl濃度 本試驗(yàn)研究了NaCl濃度對(duì)SPME萃取量的影響，對(duì)NaCl濃度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果見圖1。

由圖1可知，不同NaCl濃度萃取得到的香味物質(zhì)的種類分別為44，43，47，55，56，42，39。在低濃度的 NaCl條件下，鹽析可以提高萃取香味物質(zhì)的種類，隨著NaCl濃度的增加，萃取效率逐漸降低。相比較而言，NaCl濃度對(duì)醇類物質(zhì)的影響比酯類和酸類要明顯大一些。而鹽析可提高某幾種物質(zhì)的信號(hào)強(qiáng)度，但對(duì)其它化合物的檢測(cè)靈敏度降低。同時(shí)，鹽析作用對(duì)于極性組分的影響要遠(yuǎn)大于非極性組分，所以不同組分對(duì)于添加鹽的用量存在差異。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定在NaCl濃度為0.2g／mL時(shí)，桑椹酒萃取效果最好。

圖1 NaCl濃度對(duì)萃取量的影響Figure 1 Effect of sodium chloride concentration on extractable amount

2.1.2 萃取溫度 試驗(yàn)研究了萃取溫度對(duì)SPME萃取量的影響，對(duì)萃取溫度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果見圖2。

圖2 萃取溫度對(duì)萃取量的影響Figure 12 Effect of extraction temperature on extractable amount

由圖2可知，隨著萃取溫度的增加，出峰的個(gè)數(shù)、總峰面積和香味物質(zhì)種類都隨著萃取溫度的增加而增加；但在40℃后，出峰個(gè)數(shù)、總峰面積以及香味物質(zhì)種類都隨著溫度的變化有較明顯的減少。由于在溫度升高時(shí)較多的分析物會(huì)從基質(zhì)中逸出進(jìn)入液面的上方，增加了總峰面積、出峰個(gè)數(shù)及香味物質(zhì)的萃取效率，但超過一定溫度萃取量開始降低。下降的原因有可能是因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性的結(jié)果，乙醇吸附量會(huì)大量的積累，從而降低了其它香味成分的吸附。因此，最終選擇40℃為最佳萃取溫度。

2.1.3 萃取時(shí)間 本試驗(yàn)研究了萃取時(shí)間對(duì)SPME萃取量的影響，對(duì)萃取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果見圖3。

圖3 萃取時(shí)間對(duì)萃取量的影響Figure 3 Effect of time on extractable amount

萃取所需要的時(shí)間，由待測(cè)組分的分配系數(shù)、物質(zhì)擴(kuò)散速率、樣品基質(zhì)、樣品體積等因素決定。由圖3可知，萃取過程均在剛開始時(shí)吸附量增加迅速，出現(xiàn)一轉(zhuǎn)折點(diǎn)后上升緩慢，有的甚至出現(xiàn)下降。通過色譜分析可知，30min之前，隨著萃取時(shí)間的增加，總峰面積和出峰個(gè)數(shù)都在增加，在30min出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，總峰面積和出峰個(gè)數(shù)都隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，較明顯變化的香味物質(zhì)是酯類、醇類和酸類。由此可見，在萃取時(shí)間為30min時(shí)，萃取量達(dá)到的效果最佳，故選擇30min為最佳萃取時(shí)間。

2.1.4 平衡時(shí)間 由圖4可知，隨著平衡時(shí)間的增加，出峰個(gè)數(shù)和香味物質(zhì)的種類都有明顯的增加，而總峰面積先是變化不明顯，然后明顯增加；在30min后，隨著平衡時(shí)間的繼續(xù)增加，總峰面積、出峰個(gè)數(shù)以及香味物質(zhì)的種類都有明顯的降低。據(jù)分析可知，在萃取的過程中，形成氣－液兩相，在平衡的過程中，隨著時(shí)間的增加，分配系數(shù)發(fā)生改變，萃取頭吸取到的物質(zhì)狀態(tài)發(fā)生變化，從而影響萃取量。故選擇30min為最佳平衡時(shí)間。

2.2 桑椹酒香味物質(zhì)的定性

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知：最佳萃取條件為NaCl濃度0.2g／mL，萃取溫度40 ℃，平衡時(shí)間30min，萃取時(shí)間30min。根據(jù)最佳萃取條件，利用HS－SPME與GC－MS聯(lián)用法對(duì)桑椹酒香味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。結(jié)果見圖5和表1。

圖4 平衡時(shí)間對(duì)萃取量的影響Figure 4 Effect of equilibrium time on extractable amount

圖5 桑椹酒香味物質(zhì)成分的總離子流圖Figure 5 GC－MS total ion chromatogram of aroma compounds in mulberry wine

由圖5和表1可知，桑椹酒通過固相微萃取能夠較好的分離其中的香味成分。試驗(yàn)共分離出54種香味成分，其中酯類19種、醇類17種、酸類4種、其它14種。其中酯類、醇類、酸類分別占香味成分總數(shù)的49.68%，19.65%，6.52%。桑椹酒的主體香味含量排前12種的依次為棕櫚酸乙酯、乙縮醛、苯乙醇、乙酸異戊酯、丁內(nèi)酯、辛酸乙酯、乙酸、異丁醇、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丙醇。這12種物質(zhì)基本構(gòu)成了桑椹酒的主體香味成分。梁貴秋等［11］對(duì)桑椹果酒揮發(fā)性成分的GC／MS分析結(jié)果與本研究的結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)樯ｉ┢贩N、釀造所用菌株、釀造工藝以及萃取條件不同造成的。陳娟等［12］采用溶劑萃取結(jié)合GC－MS的方法對(duì)不同品種桑椹的香氣成分進(jìn)行分析，得知桑椹原料中主要包括高級(jí)脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇、芳香醇、脂肪醛以及脂肪酮等香氣成分，為本試驗(yàn)桑椹酒的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)依據(jù)。

表1 HS－SPME－GC－MS法分析桑椹酒中香味成分的結(jié)果Table 1 HS－SPME－GC－MS analytical results of aromatic compounds in mulberry wine

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用頂空固相微萃取和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法檢測(cè)分析了桑椹酒中的香味成分，對(duì)固相微萃取桑椹酒中香味成分的條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳萃取條件為NaCl濃度0.2g／mL，萃取溫度40℃，萃取時(shí)間30min，平衡時(shí)間30min。在最佳萃取條件下，通過氣質(zhì)聯(lián)用法共分析出54種香味成分，其中包括酯類19種、醇類17種、酸類4種、其它14種；其中含量最多的是酯類和醇類，分別占總的香味成分的49.68%和19.65%，其中含量排前十二的依次為棕櫚酸乙酯、乙縮醛、苯乙醇、乙酸異戊酯、丁內(nèi)酯、辛酸乙酯、乙酸、異丁醇、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丙醇。這12種物質(zhì)為桑椹酒的主要香味成分，構(gòu)成桑椹酒的特有品質(zhì)。

本研究從NaCl濃度、萃取溫度和時(shí)間三方面對(duì)桑椹酒香味物質(zhì)的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化，也對(duì)桑椹酒中的香味物質(zhì)做了定性分析，但影響萃取的因素是多方面的，也是綜合性的，同時(shí)，香味物質(zhì)的提取和分析方法也是多樣的，因此，后期有待深入研究，對(duì)進(jìn)一步解析桑椹酒的香味成分具有十分積極的意義。

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