磁性殼聚糖微球固定化米糠內源酶的研究

張媛媛 張 暉 王 立 錢海峰 齊希光

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

谷氨酸脫羧酶（GAD）作為米糠內源酶，可以專一的催化谷氨酸或其鈉鹽脫羧轉化為γ－氨基丁酸（GABA）。而γ－氨基丁酸作為一種重要的中樞神經系統抑制劑，具有多種重要的生理功能［1］，如降血壓、治癲癇、抗衰老、調節激素等。鑒于游離酶不便于重復利用，而與游離酶相比，固定化酶便于回收以重復利用，且相對容易分離，故越來越多的研究轉向固定化酶。如今，固定化酶的技術迅速發展，在多個領域都得到了較為廣泛的應用，如食品、醫藥、化工等［2，3］。磁性殼聚糖微球作為固定化酶的一種載體，現已被用于果膠酶、谷氨酰胺酶、漆酶、褐藻酸酶、乳糖酶、辣根過氧化物酶、脂肪酶等的固定化［4，5］。

關于谷氨酸脫羧酶的固定化，已有的報道［6，7］多是以海藻酸鈉、殼聚糖作為載體，使得制備的GABA溶液中鹽含量較高，且需離心操作，分離較繁瑣，后期的純化工作復雜，故尋找更好的固定化酶載體成為人們研究的熱點。用磁性殼聚糖微球作為載體，可以利用外界磁場的作用，簡單分離，重復利用，以有效的避免上述問題。然而目前還沒有用磁性殼聚糖固定化谷氨酸脫羧酶的報道。

本試驗以Fe3O4作為磁性內核，殼聚糖作為外殼，采用乳化交聯法來制備磁性殼聚糖微球，以此為載體來固定化谷氨酸脫羧酶，并研究固定化谷氨酸脫羧酶的酶學性質，旨在尋求一種能方便有效、且成本低廉或適中的固定化谷氨酸脫羧酶的方法，為更好的利用GAD的酶活力提供相關的理論分析和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

新鮮米糠：無錫市蘇惠米業有限公司；

Fe3O4：北京德科島金科技有限公司；

PLP、PMSF、GABA：美國Sigma公司；

2－巰基乙醇、殼聚糖：中國醫藥（集團）上海化學試劑公司；

磁鐵：友磁實業有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

超低溫冰箱：FORMA 702型，美國 Thermo life Sciences公司；

冷凍干燥機：LGJ－10型，北京四環科學儀器廠；

高速冷凍離心機：CR21GⅢ型，日本Hitachi Koki公司；

定時恒溫磁力攪拌器：90－2型，上海滬西分析儀器廠；

傅里 葉 變 換 紅 外 光 譜 儀 （Nicolet Nexus FT－IR spectrometer）：470FT－IR型，美國 Thermo Electron公司；

高速臺式離心機：TGL－IGC型，上海安亭科學儀器廠；

超級恒溫水浴：MP－501A型，上海市實驗儀器廠；

高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器）：Agilent 1100型，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 米糠谷氨酸脫羧酶的制備 參照文獻［8］，以料液比1∶4（m∶V）用緩沖液在4℃下提取米糠谷氨酸脫羧酶1h。其中，緩沖液為含有2mmol／L EDTA－二鈉、2mmol／L 2－巰基乙醇、1mmol／L PLP、1mmol／L PMSF 和 10% 甘 油 的0.05mol／L（pH＝5.6）Na2HPO4－NaH2PO4緩沖液。采用硫酸銨沉淀法從提取液中得到谷氨酸脫羧酶，之后在標準緩沖液中透析至無NH＋4，冷凍干燥后凍藏備用。

1.2.2 米糠谷氨酸脫羧酶活性的測定 用0.05mol／L（pH＝5.6）PBS緩沖液對谷氨酸脫羧酶進行復溶，制備蛋白含量約為1mg／mL的酶液，加入0.05mol／L谷氨酸鈉作為底物，40℃下反應2h，在90℃下滅酶5min，離心取上清液測定產物GABA的含量。其中GABA含量用高效液相色譜法［9］測定。以每30min生成1μmol的GABA作為一個酶活力單位。

1.2.3 米糠谷氨酸脫羧酶活力回收率的計算

1.2.4 磁性殼聚糖的制備及表征 參考文獻［10］，取0.5g Fe3O4微粒與20mL 2.5%殼聚糖乙酸溶液混合，超聲使其充分混勻，然后在攪拌下緩慢加入到80mL液體石蠟和4mL Span－80混合溶液中，常溫攪拌30min后，加入10mL 8%戊二醛，40℃恒溫水浴中攪拌1h，用1mol／L氫氧化鈉溶液將pH調至9～10，70℃恒溫水浴中繼續攪拌2h，用磁鐵吸出微球，并先后用石油醚、丙酮、蒸餾水反復洗滌，冷凍干燥得到磁性殼聚糖微球。采用激光粒度分析儀來測定磁性微球的粒徑，而采用KBr粉末壓片，用紅外光譜儀測定其官能團的特征吸收。

1.2.5 磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶的基本方法 取0.05g制備的磁性殼聚糖微球，加入到25mL錐形瓶中，用不同pH的磷酸鹽緩沖液溶脹過夜，加入一定濃度的戊二醛溶液進行交聯，用磁鐵吸出磁性殼聚糖微球，用磷酸鹽緩沖液清洗至檢測不出戊二醛。加入一定濃度的谷氨酸脫羧酶液，在4℃下固定一定時間，用磁鐵吸出磁性殼聚糖微球后，再用磷酸鹽緩沖液將微球充分洗滌。得到的固定化谷氨酸脫羧酶于4℃下保存備用。

1.2.6 磁性微球固定化米糠谷氨酸脫羧酶的條件優化研究

（1）緩沖液pH：控制戊二醛濃度為2%，交聯時間為4h，固定時間為3h，考察pH 為4.8，5.2，5.6，6.0，6.4時的酶活力回收率。

（2）戊二醛濃度：控制緩沖液pH為5.6，交聯時間為4h，固定時間為3h，考察戊二醛濃度為 1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%時的酶活力回收率。

（3）交聯時間：控制緩沖液pH為5.6，戊二醛濃度為2%，固定時間為3h，考察交聯時間為2，3，4，5，6h時的酶活力回收率。

（4）固定時間：控制緩沖液pH為5.6，戊二醛濃度為2%，交聯時間為4h，考察固定時間為1，2，3，4，5h時的酶活力回收率。

（5）正交試驗：以單因素試驗的研究結果為基礎，設計L9（34）正交試驗。

1.2.7 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的酶學性質研究

（1）最適溫度：取等量的游離和固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的PBS緩沖液中，于30，35，40，45，50℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（2）熱穩定性：取等量的游離和固定化谷氨酸脫羧酶，浸泡在PBS緩沖液中，在30，35，40，45，50，55，60，65，70 ℃精確保溫30min后，取出后迅速冷卻至室溫，換入新的含底物的PBS緩沖液，游離酶于40℃、固定化酶于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（3）最適pH：取等量的游離和固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的pH 為4.8，5.2，5.6，6.0，6.4的 PBS緩沖液中，于最適溫度下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（4）pH穩定性：取等量的固定化谷氨酸脫羧酶，分別加入pH 為4.8，5.2，5.6，6.0，6.4的 PBS緩沖液中于4℃冰箱里放置24h，取出后對微球進行清洗，換入新的含有底物的PBS緩沖液，于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

（5）操作穩定性：取固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的PBS緩沖液中，于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。15h后取出微球，換入新的含有底物的PBS緩沖液，繼續反應直至酶活力為零。

（6）貯藏穩定性：每天取等量的固定化谷氨酸脫羧酶，加入含有底物的PBS緩沖液中，于45℃下100r／min水浴振蕩制備GABA。

2 結果與討論

2.1 磁性殼聚糖的表征

圖1是殼聚糖和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖。殼聚糖圖譜在3 430cm－1處有紅外吸收峰，這是－NH2和－OH的伸縮振動，在2 870cm－1和2 930cm－1處有脂肪族C－H的伸縮振動吸收，在1 090cm－1處有C－O的伸縮振動吸收。與殼聚糖圖譜相比，磁性殼聚糖微球圖譜雖響應值有所變化，但殼聚糖的特征吸收峰都得到了保留，而且在3 430cm－1處的吸收峰較寬，這表明在磁性殼聚糖微球中存在著增強的氫鍵作用，而在573cm－1出的紅外吸收峰應是磁性內核的Fe－O特征吸收峰，從而表明Fe3O4和殼聚糖之間存在著分子間的相互作用，因此認為殼聚糖和磁性微球的乳化交聯是成功的。

圖1 殼聚糖和磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖Figure 1 Infrared Spectroscopy result of chitosan and magnetic chitosan microspheres

2.2 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的條件優化

考察了緩沖液pH、戊二醛濃度、交聯時間和固定時間4個因素對谷氨酸脫羧酶的固定化影響，根據單因素試驗結果，得到的正交試驗因素水平取值見表1，試驗設計及結果見表2。由表2可知，各因素對于酶活力回收率的影響順序為A＞C＞D＞B，谷氨酸脫羧酶固定化的最優條件為A2B2C1D3，即pH為5.2，戊二醛濃度為1.5%，交聯時間為4h，固定時間為5h。以此條件進行驗證實驗，得到酶活力回收率為39.41%。

表1 谷氨酸脫羧酶的固定化條件正交試驗因素水平表Table 1 Factors－levels of the orthogonal test for immobilization of GAD

2.3 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的酶學性質

2.3.1 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的最適溫度 由圖2可知，固定化谷氨酸脫羧酶的最適溫度由游離時的40℃向右偏移到45℃，這是因為谷氨酸脫羧酶在固定化后，載體存在著一定的傳質阻力，而底物需要更多的能量來與谷氨酸脫羧酶結合，從而增強了酶的耐熱性。而后繼續升高反應溫度時，谷氨酸脫羧酶會發生部分變性失活，從而使酶活力下降。

表2 谷氨酸脫羧固定化條件正交試驗結果Table 2 Results of the orthogonal test for immobilization of glutamate decarboxylase

圖2 溫度對游離及固定化的谷氨酸脫羧酶活力的影響Figure 2 Effect of temperature on the activities of free and immobilized glutamate decarboxylase

2.3.2 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的熱穩定性研究 由圖3可知，當處理溫度低于45℃時，隨著處理溫度的升高，游離酶和固定化酶的酶活力回收率都增大。這與前人的研究結果［11］——當植物受到外界的刺激，比如溫度升高時，體內谷氨酸脫羧酶活力會有所提升相一致。而隨著溫度繼續升高，由于谷氨酸脫羧酶發生部分熱變性，即便之后在相同的溫度下制備GABA，其酶活力都相應的逐漸降低。

2.3.3 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的最適pH 由圖4可知，游離酶的最適pH為5.6，而固定化后，酶的最適pH向左移動至5.2，這可能是因為磁性殼聚糖微球表面的帶電基團與谷氨酸脫羧酶的結合，導致其微環境遭到改變，從而影響了固定化谷氨酸脫羧酶的最適pH，使其更適合酸性環境，這樣可以相對減少在制備GABA的過程中微生物對反應的影響。

圖3 不同溫度處理對游離及固定化的谷氨酸脫羧酶活力的影響Figure 3 Effect of different temperature treatment on the activities of free and immobilized glutamate decarboxylase

圖4 pH對游離及固定化的谷氨酸脫羧酶活力的影響Figure 4 Effect of pH on the activities of free and immobilized glutamate decarboxylase

2.3.4 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的pH穩定性研究 由圖5可知，游離谷氨酸脫羧酶隨著處理pH值的增大，其酶活力回收率有先增大后降低的趨勢，而固定化后其酶活力回收率一直降低，這說明固定化后谷氨酸脫羧酶的耐酸能力變強。這可能是因為磁性殼聚糖微球作為固定化的載體，能為谷氨酸脫羧酶營造一個較為穩定的微觀環境，且殼聚糖帶有大量的氨基和羧基等基團，對酸和堿有一定的緩沖作用，兩方面的共同作用使固定化谷氨酸脫羧酶的耐酸能力增強。

圖5 不同pH處理對固定化谷氨酸脫羧酶活力影響Figure 5 Effect of different pH treatment on the activities of immobilized glutamate decarboxylase

2.3.5 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的操作穩定性研究 由圖6可知，固定化谷氨酸脫羧酶活力的衰減速度較快，其半衰期約為50h，與王筱婧等［12］用海藻酸鈉固定化米糠中谷氨酸脫羧酶的半衰期結果相一致。這可能是因為在每次反應結束后的清洗過程中，容易造成酶活力的損失。因此可適當增加每次反應的時間，或者進行連續反應，以最大程度的利用固定化谷氨酸脫羧酶。

圖6 固定化谷氨酸脫羧酶的操作穩定性Figure 6 Operation stability of immobilized glutamate decarboxylase

2.3.6 固定化米糠谷氨酸脫羧酶的貯藏穩定性研究 對固定化谷氨酸脫羧酶的貯藏穩定性進行了研究，由圖7可知，固定化谷氨酸脫羧酶在經過30d的貯藏后，其酶活力回收率依舊能保持在原來的70%左右。這說明經過固定化后，谷氨酸脫羧酶在低溫（4℃）貯藏的狀態下，其酶活力穩定性能保持較高水平。

圖7 固定化谷氨酸脫羧酶的貯藏穩定性Figure 7 Storage stability of immobilized glutamate decarboxylase

3 結論

本試驗考察了磁性殼聚糖微球固定谷氨酸脫羧酶時緩沖液pH、戊二醛濃度、交聯時間和固定時間等因素對固定化效果的影響。研究得到固定谷氨酸脫羧酶的最優條件：在pH為5.2的緩沖液中充分溶脹后，加入1.5%的戊二醛溶液交聯3h后，加入酶液固定4h，得到固定化酶活力回收率為39.41%。通過對固定化酶的酶學性質的研究，得到固定化后，谷氨酸脫羧酶的耐酸性和耐熱性得到了提高，貯藏穩定性也能在一定時間內保持較高水平。

本法較之前的固定方法，制備工藝簡單，具備工業化應用的前景；且固定化酶在制備GABA時能簡單分離，方便重復利用，后期的純化工藝也相對簡單。但要連續反應需進一步研究其再生方法，從而進一步提高酶的催化反應效率。

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12 王筱婧，王立，馬曉博，等.利用海藻酸鈉固定化米糠制備γ－氨基丁酸的研究［J］.食品工業科技，2009（4）：222～224.