蟬花菌株的篩選及菌絲體成分分析

2013-09-07 10:37:02劉素純黃曉晗

食品與機械 2013年3期

文欣劉素純黃曉晗

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙 410128；3.湖南省發酵食品工程技術研究中心，湖南長沙 410128）

蟬花（cordyceps sobolifera）亦稱蟬蛹草，是蟬花真菌寄生于蟬類若蟲而形成的結合體，因其需要特定的環境和宿主，故資源稀少。主要分布于中國浙江、江蘇、四川等多省份，在世界各地也有所分布［1］。其入藥形態為寄生于蟬蛹形成的結合體，無毒，性寒，味甘，能散風熱、解痙，主治兒童驚風夜啼、咳嗽、咬牙、咽喉癰腫等病癥［2］。在《證類本草》中記載蟬花主要用于“小兒驚癇瘈疭、夜啼、心悸”；《本草綱目》中記載其藥效“功同蟬蛻，又止瘧疾”。

蟬花中含有真菌多糖、蟲草酸、蟲草素及麥角甾醇等多種活性物質［3］，活性物質的多少與寄生類型關系較大。楊介鉆等［4］、金麗琴等［5］證明蟬花及其菌絲體具有較好的鎮痛、鎮靜及解熱等功效，同時蟬花對機體的毒性甚微，其主要化學成分與冬蟲夏草（cordyceps sinensis）相似。由于近年來蟬花生存環境遭到破壞，再之過度采挖，蟬花已經成為一種珍貴的藥材，故利用人工培養蟬花具有廣闊的前景。葛飛等［6］對天然蟬花中的粗成分進行了分析，其中粗蛋白含量為19.65%、粗脂肪含量為8.41%、粗纖維含量為3.12%、灰分為7.84%、水分含量為9.81%，蟲草酸含量為53.6mg／g，真菌多糖含量為33.2mg／g。

本試驗對蟬花中的真菌進行分離，通過液態培養獲得該菌種的菌絲體，并對蟬花菌絲體中的化學成分以及活性物質進行測定分析，為將來用蟬花真菌菌絲體替代天然蟬花作為保健品和藥品原料等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

蟬花：采自九江市廬山區蓮花鎮蓮花林場。

1.1.2 培養基

分離培養基：孟加拉紅培養基；

菌種保存培養基：PDA斜面培養基；

固態種子培養基：麩皮培養基。將麩皮和水以1∶1（m∶m）的比例混合，然后裝入500mL的三角瓶內，厚度大約0.5cm，在121℃條件下滅菌30min，備用；

液態發酵培養基：PDA液態培養基；

改良PDA液態培養基：200g新鮮馬鈴薯、10g干蟬蛻放入沸水中煮20min，用紗布過濾去殘渣，加入20g葡萄糖，補水到1 000mL；

Richard培養基：KH2PO45g，MgSO4·7H2O 2.5g，KNO310g，蔗糖50g，FeCl30.02g，H2O 1 000mL；

蛋白胨－葡萄糖－酵母膏培養基：葡萄糖10g，酵母膏10g，蛋白胨5g，水1 000mL；

麩皮－玉米：取麩皮10g，玉米粒10g，置于沸水中煮20min，用紗布過濾去掉固形物，再加入10g蔗糖，補水至1 000mL。

1.2 方法

1.2.1 蟬花真菌的分離培養稱取10g天然蟬花樣品加入到90mL無菌生理鹽水中，振蕩30min。將其稀釋成10－3，10－4，10－5稀釋液，從各稀釋液中吸取0.1mL到孟加拉紅平板并涂布，置于28℃恒溫培養箱中培養3～5d。挑選單個典型的菌落，接種到PDA斜面培養基中，保存備用。

1.2.2 蟬花真菌鑒定用點接法將蟬花真菌接種到PDA平板上進行菌落形態觀察；用插片法對蟬花真菌進行培養，通過顯微鏡作個體形態觀察。

1.2.3 液態培養生物量的獲得

（1）孢子懸液的制備：在無菌條件下挑取斜面蟬花真菌，接種到麩皮培養基中，于28℃恒溫培養箱中培養72h。取5g培養好的麩皮菌種加入到45mL無菌水中，震蕩30min，即為孢子懸液。用血球計數板測量菌懸液中孢子的數量，加入無菌生理鹽水將孢子的濃度調到106個／mL。

（2）蟬花真菌液態發酵培養基的選擇：取5mL孢子懸液，分別加入到100mL的蛋白胨－葡萄糖－酵母膏培養基、PDA液態培養基、改良PDA液態培養基、Richard培養基、玉米－麩皮培養基中，置于溫度為28℃的搖床中以150r／min的速率進行培養，培養時間為7d。從第3天開始，每隔24h對發酵液中的生物量進行測定，從而選擇最優培養基。

（3）蟬花真菌液態發酵的最佳溫度的選擇：用無菌移液管取孢子懸液5mL，加入到裝有100mL改良PDA液態培養基的三角瓶中。將恒溫搖床的溫度分別設置為22，24，26，28，30℃，搖床速率為150r／min，培養5d。測定其生物量。

（4）蟬花真菌液態發酵的最佳接種量的選擇：以接種量為1%，2%，3%，4%，5%分別將孢子懸液接種到改良PDA培養基中，于28℃的恒溫搖床中以150r／min的速率培養5d。測定其生物量。

（5）蟬花真菌液態發酵過程中搖床轉速的選擇：從孢子懸液中吸取5mL菌液，加入到裝有100mL的改良PDA培養基的三角瓶中，將其放置在轉速為110，130，150，170，190r／min的恒溫搖床上，在28℃條件下恒溫培養5d。測定其生物量。

（6）正交法確定蟬花真菌最優培養條件：選擇溫度、接種量和搖床轉速為試驗因素，設計L9（33）正交試驗以獲得最佳發酵條件。

1.2.4 測定方法

（1）生物量的測定方法：發酵液培養完成后進行冷凍離心，離心溫度為10℃、速率為4 000r／min、時間為15min。棄掉上清液，將菌絲體收集于玻璃紙上放在60℃烘箱中干燥，再進行稱量，此重量即為發酵液中的生物量。

（2）菌絲體粗成分的分析：水分含量的測定采用直接干燥法［7］；總氮含量的測定采用凱氏定氮法［8］；粗脂肪含量的測定采用索氏提取法［9］；粗纖維含量的測定采用酸堿消煮法［10］；灰分含量的測定法采用灼燒法［11］。

（3）蟲草酸的測定：根據文獻［12］所述方法，用微波提取法進行提取菌絲體中的蟲草酸。蟲草酸測定方法采用高碘酸鈉比色法［13］。將測量獲得的OD值代入回歸方程中，然后通過式（1）計算菌絲體中蟲草酸的含量。

式中：

R——菌絲體中蟲草酸含量，mg／g；

C—— 提取液中蟲草酸含量，μg／g；

10—— 試樣浸提后定容體積，mL；

V——提取液體積，mL；

m——試樣的準確重量，g。

（4）真菌多糖含量的測定：將干燥后的菌絲體進行前處理，包括：提取、醇沉、脫色、去蛋白、干燥［14］。真菌多糖的測定采用硫酸－苯酚法［15］。將測量獲得的OD值通過回歸曲線進行計算，然后代入式（2）計算出多糖含量。

式中：

R——菌絲體中真菌多糖含量，mg／g；

C—— 提取液中真菌多糖含量，μg／mL；

V——定容后體積，mL；

w——干菌絲體質量，g。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選

觀察孟加拉紅平板，發現一真菌在數量上占有優勢。經分離純化后，點接在PDA平板中觀察該菌落形態。如圖1，剛開始菌落圓形呈白色，菌絲平伏、氈狀，與培養基結合緊密，不易挑取，質地致密，菌落呈放射狀溝紋，橢圓形；形成孢子后，菌落呈灰綠色。在顯微鏡下觀察該菌個體形態（圖2），發現菌絲有隔，基部無足細胞，分生孢子以簇生形式分布于營養菌絲或孢子梗上，圓形或近似球形，其分生孢子梗經過多次分枝，產生對生的瓶狀小梗，呈掃帚狀；可初步判定其為蟬擬青霉，命名為V17。

圖1 蟬花真菌的菌落形態觀察Figure 1 Fungal colony form of Cordyceps cicadae

圖2 蟬花真菌的個體形態觀察Figure 2 Individual form of Cordyceps cicadae

2.2 發酵液中生物量的獲得

2.2.1 蟬花真菌液態發酵培養基的選擇在液態搖床培養2d時，改良PDA培養基中最先形成菌絲體，個體較小，而其他培養基在第3天開始才有較小的菌絲體形成（圖3）；隨著發酵時間的增加，發酵液中的菌絲體中逐漸長至黃豆般大小，發酵液的顏色也從暗黃色慢慢轉變到黑灰色。

從第3天開始，每隔24h對發酵液中菌絲體的生物量進行測定，結果見圖3。在液態培養過程中，隨著時間的變化，改良PDA和PDA在第5天前發酵液中的生物量逐步增加，而其他3種培養基是在第6天前生物量逐步增加。其中，在改良PDA中進行發酵的菌絲體在各個時間段的生物量均高于其他的培養基，在5d達到最大值，為5.26g／L。蟬花真菌本來是寄生于蟬蛹上生長而得，在培養基中加入的蟬蛻熬液為該微生物的生長提供了一些無機鹽或生長因子，使得它的生長速率得到提高。在5d之后，隨著發酵液中營養物質的減少、細胞的活性降低，同時次級代謝產物的生成使得菌絲自溶，從而導致了發酵液中生物量的減少。

2.2.2 蟬花真菌液態發酵的最佳溫度在不同溫度下對蟬花真菌進行液態培養，結果見圖4。該菌株在改良PDA液態培養基24～32℃的條件下均能生長，而在28℃時獲得的生物量最大，為5.26g／L。

圖3 蟬花真菌在不同培養基上發酵的生物量變化Figure 3 The biomass changed in five kinds of medium on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

圖4 發酵溫度對蟬花液態發酵的影響Figure 4 Effects of culture temperature on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

2.2.3 蟬花真菌液態發酵的最優接種量以不同的接種量進行接種，在改良PDA液態培養基28℃恒溫搖床上培養5d，獲得的生物量見圖5。接種量的多少與發酵液中的生物量有著較密切的關系，隨著接種量的增加，發酵液中的生物量也增加，直到4%時獲得最大值，為4.91g／L；而當增加到5%的時候，發酵液中的生物量有所減少。較少的接種量會使得發酵液中的菌濃度較少，使得生長遲滯期較長，不利于發酵；而過高的接種量會使得發酵液中菌過多而營養物質不足，因而獲得的菌絲體較少。

圖5 接種量對蟬花液態發酵的影響Figure 5 Effects of inoculum size on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

2.2.4 蟬花真菌液態發酵過程中的最佳搖床速率將蟬花真菌以4%的接種量接種，置于不同轉速的恒溫搖床上進行培養，獲得生物量見圖6。由圖6可知：蟬花真菌在150r／min的轉速下培養獲得的生物量最大，低于或高于該轉速時生物量較少。蟬花真菌是好氧微生物，較高搖床速率使得通氣量增加，對它的生長有促進作用；但當搖床的轉速過快，菌絲體的數量變少，這可能是培養過程中菌絲體碰撞過多而導致菌絲體難以成型。

圖6 搖床轉速對蟬花液態發酵的影響Figure 6 Effects of shaking speed on liquid fermentation of Cordyceps cicadae

2.2.5 蟬花真菌液態培養最佳條件選擇溫度、接種量和搖床轉速為試驗因素，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因子水平表L9（33）Table 1 The table of factor and level in L9（33）orthogonal experiment

正交試驗優化結果見表2。由表2可知，影響蟬花真菌液態發酵生物量的各因素主次為C＞B＞A，即搖床速率對蟬花真菌液態發酵過程中生物量的影響最大，溫度次之，接種量的大小影響最小。最佳的發酵條件為A2B2C3，發酵液中的生物量為5.94g／L。

試驗結果方差分析見表3。由表3可知，溫度和搖床速率對蟬花真菌液態發酵培養過程中的生物量影響較大，在a＝0.05水平下顯著，說明它們對蟬花真菌的生物量影響較大；而接種量在a＝0.05水平下不顯著，說明接種量對蟬花真菌液態發酵的生物量影響不大。

2.3 蟬花菌絲體粗成分分析

對干燥的蟬花菌絲體中的粗成分進行測定（粗蛋白含量、粗脂肪含量、粗纖維含量、水分含量和灰分含量）進行測定，結果見表4。菌絲體中，粗蛋白含量較高，為27.19%；粗脂肪、粗纖維的含量分別為7.79%，6.20%；而灰分含量較低。因蟬花液態發酵是純種培養，培養基中的N源和C源較為豐富，故菌絲體中粗蛋白的含量較高；而發酵液中無機元素不如蟬若蟲的含量豐富，故灰分含量較低。

表2 正交試驗結果的極差分析Table 2 Extreme value analysis of orthogonal experiment

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 The variance analysis of orthogonal test

表4 蟬花菌絲體粗成分分析Table 4 Proximate compositions of fermented fermented mycelia of Cordyceps cicadae

2.4 蟬花菌絲體中的活性成分分析

2.4.1 蟲草酸含量標準曲線與蟬花真菌含量標準曲線根據高碘酸鈉比色法，作蟲草酸（D－甘露醇）含量的標準曲線（圖7），蟲草酸含量的回歸方程：y ＝0.010 0x＋0.019 4，R2＝0.999 3。根據硫酸－苯酚法，作真菌多糖標準曲線（圖8），真菌多糖含量的回歸方程：y ＝0.006 1x－0.032 3，R2＝0.997 1。

圖7 蟲草酸（D－甘露醇）含量標準曲線Figure 7 Standard curve of D－mannitol

圖8 葡萄糖含量標準曲線Figure 8 Standard curve of glucose

2.4.2 蟬花菌絲體中蟲草酸（D－甘露醇）和真菌多糖含量的測定取0.050g干燥菌絲體加入10mL水進行微波處理，處理完后經8 000r／min離心后取上清液加入到50mL容量瓶中進行定容。測量樣液的OD值以進行蟲草酸的測定。

稱取0.050g干燥菌絲體進行前處理，處理完后裝入50mL容量瓶中用去離子水定容。測定樣液中的OD值，通過公式計算真菌多糖含量。

將測量所得的OD值通過線性回歸方程的計算得表5，由表5可知，菌絲體中蟲草酸（D－甘露醇）和蟲草多糖含量均高于天然蟬花中的含量，菌絲體蟲草酸的含量為149.52mg／g約高出天然蟬花（53.6mg／g）2倍，真菌多糖的含量為115.11mg／g約高出天然蟬花（33.2mg／g）3倍［6］。

3 結論

本試驗對蟬花中的真菌進行了研究，分離出的蟬擬青霉系天然蟬花中主要真菌。通過對其的篩選和純化，獲得了較好的發酵菌種：該菌株可以脫離蟬花宿主進行生長，采用改良PDA培養基對其進行液體發酵，培養5d可獲得較大的生物量。蟬花真菌的液態培養最優條件為28℃、接種量為4%、搖床轉速為150r／min。經工藝優化，蟬花菌絲體的產量為5.94g／L。蟬花菌絲體中的化學成分與天然蟬花含量較為接近，其中粗蛋白的含量為27.19%，粗纖維含量為6.20%，粗脂肪含量為7.79%，水分含量8.91%，灰分含量1.71%。蟬花菌絲體中蟲草酸與真菌多糖這兩種活性物質分別為149.52，115.11mg／g，比天然蟬花的含量要高。因此可以將蟬花菌絲體應用于保健食品和藥品上來替代天然蟬花，這樣可以降低生產成本。本試驗未研究蟬花菌絲體中蟲草素和麥角甾醇等活性物質，在后續的試驗中可對其他物質進行測定，這樣有利于進一步證明蟬花真菌菌絲體的食用價值和藥用價值。