植物乳桿菌發酵鹽漬辣椒汁培養基及其條件的優化

唐 鑫 夏延斌 吳 燦

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128）

植物乳桿菌既是生產發酵泡菜、發酵谷物、發酵肉制品等的重要微生物菌群之一［1］，也是人體益生菌［2－4］。其產品因具有改善人體腸道環境和增強機體免疫力等保健功能而受到越來越多的消費者的喜愛［5－9］。湖南是一個辣椒大省，當地的辣椒加工企業在辣椒制品的生產過程中，鹽漬辣椒會滲出大量的高含鹽量及營養物質豐富的辣椒汁［10］，該汁被當做廢液直接排掉，不僅造成營養物質的流失，而且污染環境。目前，乳酸菌最常用的培養基是 MRS培養基，由于MRS培養基的成本比較高，配制麻煩，而且其菌液不是食品級的原料［11］，故不能直接接入食品中用于生產。因此利用鹽漬辣椒汁為基質的食品級培養基進行菌種的擴培和種子液的制備，不僅可以節約生產成本，廢物利用，保護環境，還可以將種子液直接接種于發酵辣椒制品中，方便生產。同時通過培養基的優化設計可提高菌液中活菌的含量［12］。本試驗利用響應面法優化以鹽漬辣椒滲出汁為基質的植物乳桿菌培養基，為發酵辣椒制品種子液的制備以及發酵辣椒的生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鹽漬辣椒滲出汁：壇壇香調味品有限公司。

1.1.2 菌種

植物乳桿菌 （L.plantarumP1）：由湖南農業大學食品科技學院食品科學與生物技術湖南省重點實驗室保藏。

1.1.3 試劑

MRS肉湯：廣東懷凱微生物技術有限公司；

胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、細菌學蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器與設備

恒溫培養箱：GZ－250－S型，韶關市廣智科技設備發展有限公司；

電子天平：TP－213型，北京賽多利斯儀器系統有限公司；

超凈工作臺：SW－CJ－1FD型，蘇州凈化設備有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：WS2－84－64型，上海醫用核子儀器廠；

pH計：雷磁PHS－3C型，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽漬辣椒滲出汁的預處理 將鹽漬辣椒滲出汁直接加熱蒸發濃縮至原體積的20%，靜置冷卻以除去底部冷析出來的食鹽。再加入蒸餾水使辣椒濃縮汁與水的體積比為1∶4，制得辣椒汁備用。

1.2.2 菌濃度的測定 采用菌落平板計數法［13］測定菌落數，計算發酵液體培養基中的植物乳桿菌濃度。

1.2.3 種子液的制備 轉接斜面菌種于 MRS液體培養基中，置于35℃恒溫培養箱中靜置培養24h，備用。

1.2.4 培養基的優化

（1）不同碳源、氮源、磷源對植物乳桿菌培養的影響：在辣椒汁的基礎上，選擇蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖4種碳源，質量分數都為4%；選擇蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏4種氮源，質量分 數都為2%；選擇 K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO44種磷源，質量分數都為0.1%，其他組分均不變進行單因素試驗，按2%接種量接入發酵培養基中，初始pH為6.0，培養溫度35℃，置于恒溫培養箱內靜置培養24h，測定培養液的菌濃度并進行比較。

（2）碳源、氮源、磷源的添加量對植物乳桿菌培養的影響：選擇上述試驗的最佳碳源、氮源、磷源。碳源的質量分數分別選擇2%，4%，6%，8%，10%；氮源的質量分數分別選擇1%，1.5%，2%，2.5%，3%；磷源的質量分數分別選擇0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，進行單因素試驗。按2%接種量接種，初始pH為6.0，培養溫度35℃，置于恒溫培養箱內靜置培養24h，測定培養液的菌濃度并進行比較。

（3）響應面法優化發酵培養基：選擇上述最佳的碳源、氮源、磷源以及合適的添加量，采用三因素三水平，利用Expert－Design 8.0.5軟件，采用 Box－Behnken Design響應面法進行試驗設計，以植物乳桿菌培養基菌濃度為評價指標，確定培養基的最優配方。

1.2.5 培養條件的優化

（1）接種量對植物乳桿菌培養的影響：分別選擇接種量為1%，2%，3%，4%，5%，接種種子液于已優化的發酵培養基中，初始pH為6.0，培養溫度35℃，置于恒溫培養箱內靜置培養24h，測定培養液的菌濃度并進行比較，選擇最佳接種量。

（2）溫度對植物乳桿菌培養的影響：按上一步所得的最佳接種量接種種子液于發酵培養基中，初始pH為6.0，分別置于25，30，35，40，45℃恒溫培養箱內靜置培養24h，測定培養液的菌濃度并選擇最適宜溫度。

（3）pH值對植物乳桿菌培養的影響：將已優化的發酵培養基pH 值分別調為4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，按最佳接種量接種和最適宜溫度靜置培養24h，測定其菌濃度進行比較，得到最佳pH值。

1.2.6 生長曲線的測定 根據上述所得的優化后的培養基，按最佳條件培養，每隔3h測定其菌濃度和還原糖的含量，繪制生長曲線［14］。

2 結果與分析

2.1 培養基的優化

圖1 碳源對植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 1 Effects of carbon sources on bacteria concentration of L.plantarum

圖2 氮源對植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 2 Effects of nitrogen sources on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.1 碳源、氮源、磷源的選擇 不同的碳源、氮源、磷源對植物乳桿菌菌濃度的影響見圖1～3。由圖1可知，當葡萄糖作為碳源時，菌濃度是最高的，可達4.5×1010CFU／mL。而其他糖類作為碳源時差距并不大。可能是因為植物乳桿菌不能利用復雜的碳水化合物［7］，因此葡萄糖作為碳源更適合菌體的生長。因為在菌體的培養過程中，已有報道［1］顯示有機氮源比無機氮源更適合菌體的生長，所以本次試驗選擇了4種有機氮源進行比較。由圖2可知，蛋白胨為最適合植物乳桿菌生長的氮源。由圖3可知，在4種磷酸鹽作為磷源的條件下，K2HPO4為最適合的磷源。綜上所述，選擇葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4分別作為辣椒汁發酵培養基的碳源、氮源和磷源進行添加量選擇的單因素試驗。

圖3 磷源對植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 3 Effects of phosphate sources on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.2 碳源、氮源、磷源添加量的選擇 由圖4可知，當葡萄糖的質量分數添加到4%時，菌體濃度隨葡萄糖質量分數的增加而提高，當葡萄糖質量分數大于4%時，菌體濃度開始下降，因此選擇葡萄糖質量分數4%為最佳添加量；由圖5可知，菌體濃度隨著蛋白胨質量分數的增加而提高，當蛋白胨質量分數達到2.5%時達到最大值，之后開始下降，因此選擇蛋白胨質量分數2.5%為最佳添加量；由圖6可知，K2HPO4質量分數為0.2%時，菌濃度達到最大值，可能是因為K2HPO4含量的增加對培養基的pH造成影響所致。

圖4 葡萄糖質量分數對植物乳桿菌培養的影響Figure 4 Effects of glucose concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

圖5 蛋白胨質量分數對植物乳桿菌培養的影響Figure 5 Effects of pepton concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

圖6 K2HPO4質量分數對植物乳桿菌培養的影響Figure 6 Effects of K2HPO4concentrations on bacteria concentration of L.plantarum

2.1.3 響應面試驗設計及結果 在單因素試驗基礎上進行響應面試驗，根據Box－Behnken試驗設計原理，以葡萄糖質量分數、蛋白胨質量分數以及K2HPO4質量分數為自變量，菌濃度為響應值對發酵培養基進行優化，試驗因素水平編碼見表1，設計方案及結果見表2。

表1 辣椒汁發酵培養基響應面試驗因素和水平表Table 1 Factors and levels of response surface design／%

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Scheme and results of response surface design

利用 Design－Expert 8.0.5對表中數據進行多元回歸擬合并對模型進行方差分析，結果見表3。各因素經二次多項回歸擬合后，得到二次多項回歸方程：

由表3可知，該模型的復相關系數平方R2＝0.986 0，與校正后相關系數平方R2Adj＝0.967 9接近，說明該模型與實際擬合度好，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，因此可以用于模型分析。

表3 回歸模型方差分析表?Table 3 Variance analysis of the established regression equation for L.plantarum

由表3回歸分析結果可知，模型的F 值為54.67，P＜0.000 1，說明該模型是極顯著的。一次項 X1、X2、X3，交互項X1X2，二次項差異均為極顯著。失擬項的P＝0.262 8，說明失擬項在0.05水平上不顯著，殘差均由隨機誤差引起。因此可利用該回歸模型對試驗結果進行優化分析，確定植物乳桿菌辣椒汁發酵培養基的最佳配方。

2.1.4 響應面分析及優化 響應面分析方法的圖形是特定的響應面對應的因素葡萄糖質量分數、蛋白胨質量分數、K2HPO4質量分數所構成的三維空間圖。曲面圖的形狀可反應出各個因素對菌濃度的影響，曲面越陡峭，影響越顯著［15］。由圖7可知，三因素值選擇合理，驗證了模型的準確。為進一步確定培養基的最佳配比，用Design－Expert 8.0.5軟件進行數值優化分析，獲得最優的配比為葡萄糖質量分數3.51%、蛋白胨質量分數2.13%、K2HPO4質量分數0.22%，在此條件下得到菌濃度的理論值為4.93×1010CFU／mL。實際操作進行3次平行驗證實驗，結果得到培養液菌濃度為4.79×1010CFU／mL，與理論值較為吻合。

2.2 培養條件的選擇

由圖8可知，當接種量在2%時菌濃度最高，隨著接種量增加，菌體生長效果受到影響，可能是因為發酵初期培養基中的營養物質不能滿足過量植物乳桿菌的生長所需；這是由于接種進該研究中的培養基即一般MRS培養基的菌濃度本身不高于本培養基優化后的濃度，且當接種量過高時，該培養基并不適于植物乳桿菌的生長，使其生長所需營養物質不足，所以當接種量過高時，菌種會出現生長緩慢導致的菌濃度偏低現象，并非抑菌現象。由圖9可知，在35～40℃時，菌體濃度較高，可能是因為過低的溫度會降低酶活力使菌體生長較慢，而過高的溫度則會使細胞內蛋白質變性影響菌體的生長；由圖10可知，在pH為6.5時，菌體生長最好，所以最佳pH應控制在6.5左右。

2.3 生長曲線的測定

確定培養基的配比和培養條件后，用最佳培養基配方和最適宜生長條件培養植物乳桿菌，繪制其生長曲線及還原糖含量變化曲線，見圖11。由圖11可知，植物乳桿菌在辣椒汁發酵培養基上約在6h后進入對數生長期，當培養時間到達21h左右時，菌體生長進入穩定期，27h后菌體逐漸開始衰亡。由此可得，菌株的種齡為21h，發酵周期為27h，在優化后的條件下，活菌數可以達到4.9×1010CFU／mL。

3 結論

本試驗在單因素試驗基礎上，通過響應面法對植物乳桿菌發酵鹽漬辣椒滲出汁培養基進行優化，并得到回歸方程。經分析，確定培養基的最佳配方為葡萄糖質量分數3.51%、蛋白胨質量分數2.13%、K2HPO4質量分數0.22%，在此條件下的平均實際菌濃度為4.79×1010CFU／mL，與理論值4.93×1010CFU／mL接近。并在此基礎上進一步研究其培養條件，在接種量2%、培養溫度35℃、初始pH 6.5、發酵時間21h后，菌濃度可達到4.9×1010CFU／mL。此時該發酵液用于發酵辣椒制品效果最好。

圖7 各兩因素交互作用對發酵培養基菌濃度影響的響應面及等高線圖Figure 7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of three parameters on the bacteria concentration of fermentation medium

圖8 接種量對植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 8 Effects of inoculation amount on bacteria concentration of L.plantarum

圖9 培養溫度對植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 9 Effects of culture temperature on bacteria concentration of L.plantarum

圖10 pH值對植物乳桿菌菌濃度的影響Figure 10 Effects of pH on bacteria concentration of L.plantarum

圖11 植物乳桿菌生長曲線及還原糖含量的變化Figure 11 Growth curve of L.plantarumand change of sugar content

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