實時熒光PCR法快速檢測耐熱霉菌費氏新薩托菌

張 慧 鄭曉冬 姜 侃 汪 新 陳小珍

（1.浙江省質量檢測科學研究院理化分析檢測部，浙江 杭州 310013；2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

費氏新薩托菌（Neosartoryafischer）是一種耐熱、耐干燥、耐酸堿的菌種，廣泛分布于土壤尤其是果園的土壤中，是果蔬汁中易污染的耐熱霉菌之一。它不僅是飲料和熱加工食品中的有害菌，易引起食品貯存期間的腐敗變質［1－4］，也是人畜共患的致病菌，可引起角膜炎、心內膜炎和肺部曲霉病等，還可產生真菌毒素，嚴重威脅人們的身體健康［5－8］。目前耐熱霉菌的檢測通常采用PDA平板培養方法，檢測時間長［2］，因此，快速、準確的分子生物學檢測技術逐漸用于耐熱霉菌的檢測［9］。有研究［10，11］采用普通 PCR 技術，利用包含在核糖體單位的內部轉錄間隔區上的序列作為特異性引物，實現費氏新薩托菌的快速鑒別，但采用實時熒光PCR技術快速檢測費氏新薩托菌的研究較少。

Beta－tubulin基因序列是耐熱霉菌——費氏新薩托菌的保守序列，本試驗在此基礎上設計特異性引物和探針，優化反應體系的組成，建立實時熒光PCR快速檢測方法，對果蔬汁產品質量有效控制和保障食品安全，具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及來源

費氏 新 薩托 菌 （Neosartoryafescheri）ATCC66640、ATCC66641，雪 白 絲 衣 霉 菌 （Byssochlamys nivea）ATCC22260、ATCC18742，純 黃 絲 衣 霉 （Byssochlamys fulva）ATCC24474、ATCC24008：北京中原合聚經貿有限公司；

宛 氏 擬 青 霉 （Paecilomyces variotii）CICC4024、CICC4025：中國工業微生物菌種保藏管理中心；

宋內志賀菌 （Shigella sonnei）ATCC25931、金黃色葡萄球菌 （Staphylococous aureus）ATCC6538、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC51329、福 氏 志 賀 氏 菌（Shigella flexneri）ATCC12022、 溶 血 性 鏈 球 菌（Streptococcus hemolyticus）CMCC32210、大 腸 埃 希 氏 菌（Escherichia coli）ATCC25922：上 海 漢 尼 生 物 技 術 有 限公司。

1.1.2 主要儀器

高速離心機：Microfuge 16型，貝克曼庫爾特商貿有限公司；

電子天平：AL204型，梅特勒－托利多（儀器）上海有限公司；

實時熒光PCR儀：7300型，美國應用生物系統公司。

1.1.3 主要試劑

Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒：杭州博日科技有限公司；

PCR反應緩沖液（10×）（Mg2＋free）、MgCl2、dNTP（三磷酸脫氧核糖核苷）混合物、DNA聚合酶：寶生物工程（大連）有限公司；

ROX染料：上海位點生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養 費氏新薩托菌在馬鈴薯葡萄糖培養基中培養3～6d（25℃），觀察有菌絲體或菌絲球形成，挑出，以備提取DNA使用。

1.2.2 模板DNA提取 將1.2.1中制備的菌絲體參照Biospin真菌基因組DNA抽提試劑盒說明進行操作處理，提取真菌DNA模板。

1.2.3 引物設計 費氏新薩托菌引物設計參考KACC41668beta－tubulin的部分基因序列。利用PrimerExpressTM（V3.0，美國ABI公司）軟件分析和設計引物和Taq－Man探針位點，序列見表1。引物和探針由Invitrogen公司合成。

表1 引物與Taqman探針序列Table 1 Specific primer and Taqman probe sequences

1.2.4 實時熒光PCR反應體系的優化

（1）實 時 熒 光 PCR 反 應 條 件：95 ℃ （3min），95 ℃（15s）、59℃（40s）、40個循環。

（2）實時熒光PCR反應體系按表2初始體系組成開始優化，依次優化ROX染料、Mg2＋、DNA聚合酶、dNTP混合物的用量。

表2 實時熒光PCR反應體系組成Table 2 Real－time PCR reaction system

1.2.5 特異性試驗 分別應用1.1.1中顯示的費氏新薩托菌、雪白絲衣霉菌、純黃絲衣霉菌、宛氏擬青霉菌和多株非耐熱霉菌，提取DNA后，按試驗優化的方法進行實時熒光PCR反應，驗證費氏新薩托菌檢測的特異性。

1.2.6 靈敏度試驗 以費氏新薩托菌標準菌株ATCC66640為參考菌株，提取 DNA，提取液（57ng／μL）進行10倍梯度稀釋，使 DNA 濃度約為101，100，10－1，10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7ng／μL，應用以上 DNA 按優化的實時熒光PCR方法檢測，觀察結果，考察靈敏度。

2 結果與分析

2.1 PCR體系中探針的適用性和ROX染料用量選擇

采用7300型PCR儀進行實時熒光PCR試驗時，通常在反應體系中添加ROX熒光染料，用以校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差等，提供一個穩定的基線。

圖1顯示出不同ROX用量對費氏新薩托菌的PCR擴增結果的影響不同。0.8～2.0μL ROX的PCR體系均呈對數曲線擴增，0.8μL用量的曲線1不夠平滑，綜合考慮，選取1.2μL ROX用量作為以后試驗中費氏新薩托菌實時熒光PCR擴增用量。

2.2 PCR體系中 Mg2＋濃度的選擇

Mg2＋是影響Taq酶活性的關鍵因素，Mg2＋濃度過高，會增加非特異性擴增；Mg2＋濃度過低，影響Taq酶發揮最佳活性。因此，PCR反應體系中Mg2＋濃度的選擇至關重要。

圖2顯示了Mg2＋濃度對費氏新薩托菌實時熒光PCR的影響，當 Mg2＋的用量為0.5，1.0μL時，均未出現對數擴增的曲線，說明PCR體系中Mg2＋濃度過低，影響了PCR擴增的正常進行。由圖2可知，費氏新薩托菌適宜的Mg2＋用量在1.5～3.5μL。綜合考慮，2.5μL Mg2＋用量作為費氏新薩托菌以后PCR試驗的用量。

圖1 不同ROX用量對實時熒光PCR擴增影響Figure 1 Effect of ROX concentration on real－time PCR amplification

圖2 Mg2＋濃度對實時熒光PCR擴增影響Figure 2 Effect of Mg2＋ concentration on real－time PCR amplification

2.3 PCR體系中DNA聚合酶用量的選擇

DNA聚合酶是以DNA為復制模板，將DNA由5＇端點開始復制到3＇端的酶。DNA聚合酶是DNA片段擴增的關鍵物質。圖3顯示了不同的DNA聚合酶用量對費氏新薩托菌實時熒光PCR的影響，當酶的用量在0.2～0.6μL時，獲得了良好的對數擴增曲線，并且不同酶用量的熒光強度差別不大。因此，認為PCR反應體系中0.2μL的用量即可滿足實時熒光PCR擴增需求。

2.4 PCR體系中dNTP用量的選擇

dNTP又叫三磷酸脫氧核糖核苷，dNTP混合液是三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的摩爾比為1∶1∶1∶1的混合物，是構成DNA鏈的基本組成物質。

dNTP過少，影響PCR擴增效率；過量，dNTP可與Mg2＋結合，從而降低體系中Mg2＋濃度，造成Taq聚合酶活性下降。圖4中費氏新薩托菌在dNTP用量為2.0，3.0，4.0μL時的PCR擴增效率較好，熒光信號的強度較高。為既滿足試驗需求又節約成本，以2.0μL為后續PCR試驗用量。

圖3 DNA聚合酶用量對實時熒光PCR擴增影響Figure 3 Effect of DNA polymerase concentration on real－time PCR amplification

圖4 dNTP用量對實時熒光PCR擴增影響Figure 4 Effect of dNTP concentration on real－time PCR amplification

綜上所述，經過優化后費氏新薩托菌的實時熒光PCR反應體系組成見表3。

2.5 特異性

實時熒光PCR檢測費氏新薩托菌特異性的擴增結果見圖5。圖5顯示該菌的引物和探針只對費氏新薩托菌（ATCC66640、ATCC66641）產生擴增，而對其他非費氏新薩托菌均無交叉反應，特異性良好。

2.6 靈敏度

對費氏新薩托菌的DNA提取物進行10倍梯度稀釋后，進行實時熒光PCR反應，檢測結果見圖6。費氏新薩托菌最低8.6×10－4ng／反應體系的DNA能夠被擴增；其他更低的稀釋度沒有信號增長。

3 討論

費氏新薩托菌是人畜共患的致病菌，易污染果蔬汁而引起產品變質，脹罐胖聽。本試驗根據Genbank公布的betatubulin基因序列，設計了特異性引物和Taqman探針，建立了費氏新薩托菌的實時熒光PCR檢測方法。與前人所建的費氏新薩托菌PCR檢測方法［10，11］相比，該方法利用熒光探針通過實時熒光PCR實時監測目的基因的擴增，整個檢測過程為完全閉管狀態，避免了污染；同時，無需電泳等PCR后處理過程，快速、準確。實時熒光PCR反應體系中ROX染料、Mg2＋濃度、DNA聚合酶和dNTP用量等，對PCR擴增反應的正常進行均有一定的影響，通過各梯度試驗確定，25μL的反應體系中，1.2μL ROX 染料（10μΜ）、2.5μL MgCl2（25mM）、0.2μL DNA 聚合酶（5U／μL）、2.0μL dNTP混合物（2.5mM）、2.5μL 10×PCR反應緩沖液為適用于費氏新薩托菌擴增的最佳反應體系，基因組DNA的靈敏度為8.6×10－4ng／反應體系，方法特異性較好。該方法的建立為耐熱霉菌費氏新薩托菌的快速檢測提供了新思路。

表3 優化后的費氏新薩托菌實時熒光PCR反應體系Table 3 The optimal real－time PCR system

圖5 費氏新薩托菌的特異性Figure 5 Specificity of real－time PCR for Neosartoryafescheri

圖6 費氏新薩托菌實時熒光PCR檢測靈敏度Figure 6 Sensitivity of real－time PCR for Neosartoryafescheri

1 Nielsen P V，Beuchat L R，Frisvad J C.Growth of and fumitremorgin production by Neosartoryafischeri as affected by temperature，light，and water activity［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1988，54（6）：1 504～1 510.

2 郭偉鵬，吳清平，張菊梅，等.果汁飲料中耐熱霉菌的分離和鑒定研究［J］.生物技術通報，2008（增刊）：244～247.

3 祝紅昆.耐熱性霉菌引起果蔬汁飲料腐敗問題的實驗探討［J］.云南大學學報（自然科學版），2008，30（S1）：359～362.

4 郝天婷，周幗萍.2例果汁飲料中污染真菌的鑒定分析［J］.中國釀造，2010（9）：155～157.

5 Tournas V.Heat－resistant fungi of importance to the food and beverage industry［J］.Crit Rev Microbiol，1994，20（4）：243～263.

6 Summerbell R C，L de Repentigny，C Chartrand，et al.Graftrelated endocarditis caused by Neosartoryafischeri var.spinosa.［J］.J.Clin.Microbiol.，1992，30（6）：1 580～1 582.

7 Girardin H，Monod M，Latge J.Molecular characterization of the food－borne fungus Neosartoryafischeri （Malloch and Cain）［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1995，61（4）：1 378～1 383.

8 Silva F V，Gibbs P.Target selection in designing pasteurization processes for shelf－stable high－acid fruit products［J］.Crit Rev Food Sci.Nutr.，2004，44（5）：353～360.

9 張慧，鄭曉冬，姜侃，等.PCR快速檢測耐熱霉菌雪白絲衣霉菌［J］.食品與機械，2012，28（6）：96～98.

10 Lau A，Chen S，Sorrell T，et al，Development and clinical application of a panfungal PCR assay to detect and identify fungal DNA in tissue specimens［J］.J.Clin.Microbiol.，2007，45（2）：380～385.

11 Emmanuelle C N T，Robert A.Method for detecting heat－resistant micro－organisms capable of contaminating certain food products：United States，6117636［P］.2000－09－12.