醬油曲中谷氨酰胺酶酶活測定條件優化

鄒敏娟

（佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000）

釀造醬油的主要原料大豆蛋白經微生物酶解之后形成各種氨基酸，是醬油呈鮮味的主要原因，而各種氨基酸中，谷氨酸對鮮味的貢獻最為顯著，故其含量更為重要［1，2］。據報道［3］，原料中所含有的谷氨酸有46%左右是作為谷氨酰胺存在的，后者需經谷氨酰胺酶水解才能成為谷氨酸。故醬油曲料中的谷氨酰胺酶的酶活是影響醬油發酵中L－谷氨酸得率的關鍵因素。因此谷氨酰胺酶活力是評價醬油制曲質量的一項重要指標。

目前谷氨酰胺酶的酶活檢測通常采用蒸氨法和康維皿彌散法測定酶解底物產生的NH3。韓銘海等［4］篩選谷氨酰胺酶活高的菌株采用蒸氨法，通過微量蒸氮裝置，將蒸出的NH3用納氏試劑吸收進行顯色反應。陳妙玲等［2］采用康維皿彌散法進行高谷氨酰胺酶活的菌株篩選，該法是通過硼酸吸收NH3，然后用標準鹽酸溶液滴定硼酸，從而計算出產生的NH3量。袁振遠等［5］分析和比較了蒸氨法和康維皿兩種檢測方法，在蒸氨和硼酸吸收過程中都有步驟繁瑣，耗時長，影響因素多，結果穩定性不佳等缺陷，導致未能很好的推廣。近年也有些學者［6］采用高效液相對酶解產物L－谷氨酸含量進行檢測，結果準確性和重現性較好，但是設備和耗材投入較大，不易于推廣。

本研究采用L－谷氨酸快速檢測試劑盒和可見分光光度計，通過測定酶解底物產生的L－谷氨酸含量，從而建立了醬油曲料中谷氨酰胺酶酶活的快速檢測方法，同時通過單因素試驗和中心組合試驗設計來研究反應底物濃度、反應pH值、反應溫度對測定谷氨酰胺酶酶活的影響，并找出最佳測定條件的組合。該方法快速，設備和耗材投入少，結果重現性良好，具有良好的推廣前景，可為醬油生產過程質量控制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

醬油成曲：佛山市海天調味食品股份有限公司；

鹽酸、乙醇：分析純，廣州化學試劑廠；

L－谷氨酸、L－谷氨酰胺：純度＞99%，美國西格瑪奧德里奇公司；

L－谷氨酸檢測試劑盒：德國R－Biopharm公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：BS224S型，賽多利斯天平有限公司；

水浴鍋：DK－S24型，環凱微生物科技有限公司；

粉碎機：DFT－50型，大德中藥機械有限公司；

可見光分光度計：721N型，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 將曲料試樣混合均勻后，取約30g于粉碎機中進行粉碎。

1.2.2 酶解反應 稱取粉碎后曲料3g，加入反應底物谷氨酰胺溶液20mL，保溫酶解反應，然后加入5mL 2mol／L鹽酸溶液終止反應，然后加水定容至1 000mL，過濾后濾液備用。空白對照用磷酸緩沖溶液代替谷氨酰胺溶液，加入5mL 2mol／L鹽酸溶液，保溫酶解反應后加水定容至500mL，過濾后濾液備用。

1.2.3 酶解反應產物L－谷氨酸含量的測定 分別測定0.006，0.010，0.020，0.040，0.060g／L的L－谷氨酸含量對應的吸光值，以L－谷氨酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。分別吸取酶解反應后試樣濾液和空白試驗濾液50μL，測定其中L－谷氨酸含量。

1.2.4 谷氨酰胺酶活力 在一定溫度和pH值的條件下，每克醬油曲中的谷氨酰胺酶每分鐘催化L－谷氨酰胺分解生成1μmol L－谷氨酸，即為一個酶活力單位，以U／g表示。

1.2.5 單因素試驗

（1）反應底物濃度對酶活的影響：按反應底物濃度為1.50%，2.25%，3.00%，3.50%，3.75%，反應 pH 值為7.4，反應溫度為35℃，檢測谷氨酰胺酶活。

（2）反應pH值對酶活的影響：按反應pH值為7.0，7.2，7.4，7.6，7.8，反應底物濃度為3.50%，反應溫度為35℃，檢測谷氨酰胺酶活。

（3）反應溫度對酶活的影響：按反應溫度為30，35，37，40，45℃，反應pH為7.2，反應底物濃度為3.50%，檢測谷氨酰胺酶活。

1.2.6 酶活測定條件的優化試驗 谷氨酰胺酶廣泛存在于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母與真菌中［7］。不同來源的谷氨酰胺酶作用的溫度、pH值、底物專一性等條件均有所差異。本研究采用響應面分析方法對谷氨酰胺酶酶活測定最佳參數進行了驗證。在單因素試驗的基礎上，采用二次回歸正交旋轉組合設計［8］的方法對酶活測定條件進行優化。

2 結果與分析

2.1 曲料中谷氨酰胺酶水溶性分析

根據文獻［9］報道，曲料谷氨酰胺酶分為胞外酶和胞內酶，其中胞外酶位于菌絲體細胞壁外，易溶于水，而胞內酶則附在細胞壁上，不溶于水。因此用水對粉碎后的曲料進行提取，胞外酶能釋放到上清液中，胞內酶則殘留在曲料渣中。在其他檢測參數不變的條件下，分別對曲料整體（上清液＋曲料渣）和曲料渣（去上清）進行谷氨酰胺酶活力進行測定，分析其水溶性，檢測結果見表1。由表1可知，不同曲料渣的谷氨酰胺酶占曲料整體酶活比值稍有差異，但可以看出，曲料大部分的谷氨酰胺酶為胞內酶，殘留在曲料渣中。因此本方法對曲料谷氨酰胺酶活力進行檢測時，采用曲料整體（上清液＋曲料渣）參與酶解反應。

表1 曲料整體與曲料渣檢測結果對比Table 1 Results of total soy sauce koji and residues of soy sauce koji

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 反應底物濃度的影響 由圖1可知，底物濃度高達

3.5 %時，酶促反應速度最大，當底物濃度超過3.5%時，對酶促反應的影響不顯著。根據酶反應動力學原理，酶促反應速度隨著底物濃度增加而增加。當底物濃度增加到一定程度，

酶活性中心分子逐步被飽和，酶促反應速度的增加率會明顯減緩［10，11］。故選擇3.5%為酶活檢測的最佳濃度。

2.2.2 反應pH值的影響 反應體系過酸或過堿可以使酶的空間結構被破壞，引起酶構象的改變，酶活性喪失。此外還會影響底物、酶分子活性部位和中間絡合物ES的相關基團的解離狀態，不利于催化反應［10，11］。由圖2可知，隨著pH值的上升，酶活也不斷上升，當pH值上升到7.2時酶活達到最高點，pH值再繼續上升，酶活開始明顯下降，可見pH為7.2時，酶活結果最高。

圖1 谷氨酰胺底物對酶活的影響Figure 1 Influence of substrate concentration to the enzymatic activity of glutaminase

2.2.3 反應溫度的影響 反應溫度對酶反應速度有雙重影響，溫度越高反應越快，但是當溫度高達一定程度時，會引起酶蛋白的變性，導致反應速度減慢［10，11］。由圖3可知，隨著反應溫度的上升，酶活也不斷上升，當pH值上升到37℃時酶活達到最高點，而反應溫度再繼續上升，酶活開始明顯下降，可見反應溫度為37℃時，酶活最高。

圖2 反應pH對酶活的影響Figure 2 Influence of pH to the enzymatic activity of glutaminase

圖3 反應溫度對酶活的影響Figure 3 Influence of reaction temperature to the enzymatic activity of glutaminase

2.3 中心組合試驗結果

2.3.1 試驗因子及編碼水平 根據單因素試驗結果，取底物濃度、反應pH值、反應溫度3個因素為二次回歸正交旋轉組合設計的影響因子，并確定出各因子的恰當水平，見表2。

表2 響應面試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in response surface design

2.3.2 二次回歸正交旋轉組合設計方案及結果 采用經典的三因素三水平Box－Behnken試驗設計，以谷氨酰胺酶酶活為響應值Y，作三因素三水平的15個響應面試驗。自變量取值在X1，X2，X3所構成的三維頂點，共有12個析因點；3個零點重復，用以估計試驗誤差。試驗設計方案與結果見表3。

表3 Box－Behnken試驗設計與結果Table 3 Box－Behnken experimental design and result

根據表3的試驗結果，用分析軟件進行多元回歸分析，所得的主要分析結果見表4和表5。

由表4可知，回歸模型的F值為51.68，P值為0.000＜0.01，達到極其顯著水平；而失擬項的F 值為0.39，P值為0.775＞0.05，差異不顯著，說明該模型擬合結果良好。線性為顯著水平，平方項也達到極其顯著水平，說明各因素對酶活有顯著的影響。

表4 回歸方程方差與顯著性分析表?Table 4 Variance of regression equation and significant analysis

表5 交互與顯著性分析表Table 5 Analyze of mean square

經回歸擬合后，試驗因素對響應值的影響可用回歸方程表示為：

2.3.3 驗證實驗 根據上述回歸方程作出響應面分析圖（見圖4）。

通過圖4和圖5可知，回歸模型存在最大值點，Y的最大評估值為6.61，各因素的取值分別為底物濃度3.126 3%、反應溫度36.98℃、反應pH 7.2。在以上優化條件下進行3次驗證實驗，結果為6.65，6.60，6.55U／g，平均值為6.60U／g，說明試驗值與預測值有較好的擬合性。

圖4 底物濃度、反應pH值、反應時間對酶活影響的響應面圖和等高線Figure 4 Response surface of reaction substrate concentration，pH and temperature on activity of glutaminase

2.4 方法精密度

對同一樣品（粉碎處理后）稱取6組進行酶解反應和L－谷氨酸測定，計算谷氨酰胺酶活力和變異系數，進行重復性分析。由表6可知，方法精密度符合 GB／T 27404——2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢驗》附錄F“檢測方法確認的技術要求”中精密度要求。

圖5 預測值圖Figure 5 The predicted value of glutaminase

表6 方法精密度分析Table 6 Repeatability analysis of the results

3 結論

通過對醬油曲料中谷氨酰胺酶的水溶性進行探究，從試驗結果得出了大部分的酶屬于胞內酶，這些胞內酶對發酵過程中谷氨酰胺轉換成品呈鮮味物質——L－谷氨酸起決定性作用。同時通過響應面分析方法，研究了底物濃度，反應pH值和反應溫度等試驗因素之間的交互作用，通過次數較少的試驗，在短時間內確定了各因素對檢測結果的影響程度，獲得了最佳檢測參數，對檢測方法的開發和優化起到顯著的促進作用。

本研究建立的谷氨酰胺酶酶活快速檢測方法，相比傳統的蒸氨法、康維皿彌散法和液相法具有步驟簡單，耗時短，檢驗成本低，并且結果重現性良好，因此易于推廣應用，為醬油生產過程中質量控制提供了基礎數據。

1 陳陶聲，林祖申.醬油及醬類的釀造［M］.北京：化學工業出版社，1991：5～6.

2 馬永強，宮安旭，陳曉昕，等.醬油制曲過程中蛋白酶和谷氨酰胺酶活影響因素［J］.食品科學，2010，31（17）：294～297.

3 陳紅玲.谷氨酰胺酶高產菌滬釀3.422米曲霉的育種［J］.中國釀造，1990（3）：30～40.

4 韓銘海，趙娟娟，華盛龍，等.一株高產谷氨酰胺酶菌株的鑒定和酶活特性的研究［J］.大豆科學，2008，27（6）：1 037～1 040.

5 袁振遠，馮禧瑞.米曲霉的谷氨酞胺酶［J］.中國調味品，2003（4）：33～35.

6 余斌，汪仕良，尤忠義，等.香豬燒傷后腸道補充谷氨酰胺對谷氨酰胺酶活力的影響［J］.第三軍醫大學學報，1996，18（1）：5～7.

7 何燦，高紅亮.谷氨酰胺酶的應用研究進展［J］.安徽農業科學，2012，40（32）：15 883～15 885.

8 王磊，林奇.板栗淀粉酶水解工藝條件研究［J］.食品與機械，2010，26（1）：152～156.

9 安井卓男，四方日出男，石上有造.關于醬油曲的谷氨酰胺酶——全谷氨酰胺酶活性高的菌株的尋找及在諸位中谷氨酸的溶出［J］.醬研，1982（8）：78～86.

10 羅科麗，彭喜春，晏日安.微生物谷氨酰胺酶的研究進展［J］.中國調味品，2010，35（11）：30～34.

11 詹壽年，吳擁軍，郭倩倩，等.高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢桿菌的篩選及glsA基因的克隆［J］.貴州農業科學，2011，39（6）：119～122.