不同Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌抗菌活性的研究

彭登峰 柴春祥 馬 玲 王 偉

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津 300134；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801）

干酪中添加益生菌可以對人體起到非常好的作用，嗜酸乳桿菌是人體腸道中的重要微生物，它能調(diào)節(jié)人體腸道微生物菌群平衡，增強機體免疫力以及抑制腫瘤細胞形成［1］；雙歧桿菌可以抑制病原菌的生長，與發(fā)酵乳和酸奶相比，干酪具有較高的pH值，因此干酪更加支持酸敏感性雙歧桿菌的長期存活［2］；植物乳桿菌具有維持腸道內(nèi)菌群平衡、促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、緩解乳糖不耐癥及抑制腫瘤細胞的形成等多種功能［3］。

酪蛋白抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，具有廣譜抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生蟲及抗腫瘤等生物活性［4］。干酪中豐富的酪蛋白是抗菌肽的重要來源。近年來干酪中酪蛋白抗菌肽的抑菌性引起了人們的廣泛關(guān)注和研究。目前已于酪蛋白酶解物中發(fā)現(xiàn)了多種具有抑菌性的抗菌肽［5］。

現(xiàn)階段中國對干酪抗菌肽的研究較少。本試驗以不同成熟期的添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的3種Mozzarella干酪為原料，用3種方法制備干酪的提取液，驗證提取液對枯草芽孢桿菌的抗菌性。本試驗的意義在于驗證干酪中提取液的生理功能以及對微生物的抑制作用，為干酪抗菌肽的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)與理論前提。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設(shè)備

1.1.1 原料乳

新鮮牛乳：密度1.030g／mL，干物質(zhì)11.05%，蛋白含量3.03%，酪蛋白含量2.27%，將脂肪標(biāo)準化至3.0%，使 C／F（酪蛋白∶脂肪）的比值為0.76，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站。

1.1.2 供試菌種

Streptococcus salivarius subsp.thermophilus （唾 液 鏈球 菌 嗜 熱 亞 種 ）CH9、Lactobacillus delbrueckil subsp.bulgaricus（德氏乳桿菌保加利亞亞種）LB、Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳桿菌）、Bifidobacteriasp.（雙歧桿菌）、Lactobacillus plantarum （植 物 乳 桿 菌）、Bacillus subtilis（枯草芽孢桿菌）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實驗室。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備

氫氧化鈉：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；

冰醋酸、醋酸鈉、三氯乙酸：均為分析純，天津市嘉興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司；

濾片紙：化學(xué)分析濾紙，杭州特種紙業(yè)有限公司。

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101FA－3型，上海申光儀器儀表有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：HPP－9272型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

真空充氣包裝機：DZQ 550L型，杭州佑天元包裝機械制造有限公司；

醫(yī)療型潔凈工作臺：DL－CJ－2F型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Mozzarella干酪的制作 參照文獻［6］來制作 Mozzarella干酪。本試驗根據(jù)所加入的發(fā)酵劑不同制備3種Mozzarella干酪。第1種是按原料乳量0.5%加入CH9和LB組成的混合發(fā)酵劑和0.5%的嗜酸乳桿菌，第2種是按原料乳量0.5%加入CH9和LB組成的混合發(fā)酵劑和0.5%的雙歧桿菌，第3種是按原料乳量0.5%加入CH9和LB組成的混合發(fā)酵劑和0.5% 的植物乳桿菌。

1.2.2 Mozzarella干酪抗菌物質(zhì)的提取

（1）無菌蒸餾水提取法：稱取 Mozzarella干酪30g，切碎、研磨后放入燒杯中，加入100mL無菌蒸餾水，攪拌均勻后靜置1h，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。

（2）醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取法：稱取 Mozzarella干酪30g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100mL pH為4.6的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

（3）三氯乙酸溶液提取法：稱取Mozzarella干酪30g，經(jīng)切碎、研磨后放入燒杯中，然后向燒杯中加入100mL 12%的三氯乙酸溶液，其余同無菌蒸餾水提取法。

本試驗在干酪成熟40，50，60d時分3次提取，每次提取時采用以上3種方式。

1.2.3 菌種活化與接種涂布 將經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基裝入試管后擺斜面，在無菌條件下用劃線法將供試菌種移接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，于37℃ 培養(yǎng)18～24h，進行菌種斜面活化［7］。

取無菌培養(yǎng)皿，做標(biāo)記后迅速倒入培養(yǎng)基20mL，并快速輕巧地晃動培養(yǎng)皿，平置冷卻備用［8］。

分別在培養(yǎng)皿中用移液槍移取少量的無菌蒸餾水，滴到培養(yǎng)皿的中央，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記接種枯草芽孢桿菌，接種時要將菌融在無菌蒸餾水中，然后用涂布器涂勻。

1.2.4 提取液抗菌活性的測定 參照文獻［8～10］并做適當(dāng)改進，采用濾紙片法測定提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用。

濾紙片法：用無菌鑷子夾住滅菌后的濾紙片分別在不同的提取液中浸泡一下，在瓶口濾去多余樣液，然后根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記貼到相應(yīng)的位置，貼完后把培養(yǎng)皿放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完成后，取出，觀察抑菌效果和測量抑菌圈的直徑。

1.2.5 空白的制作 分別量取100mL的無菌蒸餾水、pH為4.6的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液和12%的三氯乙酸溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到貼壁狀態(tài)，然后用少量的無菌蒸餾水把貼壁的物質(zhì)溶解出來，倒入清洗干凈并經(jīng)過殺菌的小瓶中。根據(jù)培養(yǎng)皿的標(biāo)記用濾紙片法測定3種空白提取液是否對試驗結(jié)果造成影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖1可知，3種方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。無菌蒸餾水提取的成熟期為40，50，60d添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性相差不大，抑菌圈直徑分別為1.00，0.98，1.01cm；用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為40d添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.93cm；TCA提取的成熟期為40d添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為2.78cm。

圖1 添加嗜酸乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用Figure 1 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus acidophilus on Bacillus subtilis

2.2 添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用

由圖2可知，3種方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。無菌蒸餾水提取的成熟期為40d添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.18cm；用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為40d添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.99cm；TCA提取的成熟期為60d添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為3.05cm。

圖2 添加雙歧桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用Figure 2 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Bifidobacteriaon Bacillus subtilis

2.3 添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用

圖3 添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用Figure 3 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus plantarumon Bacillus subtilis

圖4 不同成熟期添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抗菌性Figure 4 Antibacterial activity of extract of Mozzarella cheese added Lactobacillus plantarumduring different ripening on Bacillus subtilis

由圖3、圖4可知，3種方法提取的不同成熟期Mozzarella干酪的提取液對枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。無菌蒸餾水提取的成熟期為60d添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為1.25cm；用醋酸－醋酸鈉緩沖溶液提取的成熟期為60d添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為2.18cm；TCA提取的成熟期為40d添加植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為3.28cm。

3 結(jié)論

（1）不同成熟期添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液對枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用。

（2）3種提取方法中，TCA提取法提取不同 Mozzarella干酪在不同成熟期的提取液對枯草芽孢桿菌的抑制作用相對較好，其制備的提取液可能含有更多種類的抗菌肽。

（3）用TCA提取法提取出添加嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的Mozzarella干酪成熟40d時的提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑分別為2.78cm和3.28cm。

（4）用TCA提取法提取出添加雙歧桿菌的 Mozzarella干酪成熟60d時的提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌性最強，抑菌圈直徑為3.05cm。

（5）添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的Mozzarella干酪提取液主要含有酪蛋白，酪蛋白具有豐富的生物活性序列［11］，酪蛋白抗菌肽通過破壞細胞膜結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞呼吸和DNA合成等機制來達到抑制枯草芽孢桿菌的作用。隨著干酪的成熟，酪蛋白在凝乳酶和發(fā)酵劑微生物產(chǎn)生的蛋白分解酶的作用下形成抗菌肽。添加嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌對Mozzarella干酪的成熟有一定的影響，從而影響抗菌肽的形成，同時，提取方法不同，提取液中所含的肽類不同或者濃度不同，從而對枯草芽孢桿菌的抗菌性不同，TCA提取法制備出的提取液可能含抗菌肽的濃度大或者種類多，抑菌圈直徑較大。至于嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌對Mozzarella干酪提取液抗菌性的影響，還有待進一步的試驗研究。

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