非小細胞肺癌T790M基因突變研究進展

李慧 張爽 綜述 程穎 審校

近年來,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治療領域里程碑式的改變是針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變陽性的晚期患者采用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)進行治療.治療獲益的患者表現為無疾病進展期(progression-free survival, PFS)延長,客觀反映率(objective response rate, ORR)提高,生活質量得到極大改善.盡管對初始EGFR-TKI治療應答良好,但大部分患者在平均治療10個月后會出現對此類藥物的耐藥.早期的研究[1,2]發現,使用EGFR-TKI治療后進展的腫瘤中,50%存在EGFR基因20號外顯子第790位點的突變,即T790M基因突變.轉染攜帶T790M基因突變的質粒的腫瘤細胞對EGFR-TKI的耐藥性明顯增加.隨后更多的研究[3]結果也驗證了腫瘤組織中T790M基因突變是導致EGFR-TKI耐藥最主要的機制.隨著臨床研究的拓展和檢測技術的更新,研究者發現使用EGFR-TKI前的NSCLC中也存在一定比例的de novo T790M基因突變[4,5],由此引發了T790M基因突變是獲得性模式還是選擇性模式的爭論.此外,T790M基因突變是否與藥物療效預測和生存預后相關以及是否是EGFR-TKI的禁忌癥等問題都還沒有定論.本文總結近年來有關T790M和EGFR-TKI耐藥方面的重要研究結果,闡述對T790M基因突變的共識和爭議之處.

1 T790M基因突變的發現及耐藥機制

1.1 T790M基因突變的發現 2005年Kobayashi等[1]對1例71歲、男性、應用EGFR-TKI治療后疾病進展的NSCLC患者進行二次活檢時發現,該腫瘤組織中除了治療前檢測出來的EGFR第19號外顯子缺失之外(19Del),還增加了20號外顯子T790M基因突變.該患者既往接受過二線吉非替尼治療,達到完全緩解(complete response, CR)28個月后出現疾病進展.研究人員將T790M基因突變質粒轉染腫瘤細胞后,該腫瘤細胞開始對吉非替尼產生耐藥.同年Pao等[2]對6例接受TKI治療后疾病進展的腫瘤組織/胸水標本再次進行EGFR基因突變檢測,相比治療前,3例標本(50%)新增加了T790M基因突變.隨后對155例治療前腫瘤標本的檢測結果證實所有標本都不存在de novo T790M基因突變.體外試驗證實同時攜帶EGFR基因21號外顯子L858R基因突變和T790M基因突變的腫瘤細胞對TKI的耐藥性是單獨攜帶L858R基因突變腫瘤細胞的100倍.基于以上兩個重要的研究結果,T790M基因突變被一致認為是導致EGFR-TKI繼發性耐藥的主要原因,它也是第一個被發現的與耐藥相關的基因.隨后更多的報道證明,不同種族或不同地域EGFR-TKI耐藥患者的腫瘤組織中都發現有新增加的T790M基因突變.Chen等[6]采用ARMS法檢測29例中國人NSCLC(86%為腺癌)后發現,二次活檢腫瘤組織中T790M基因突變率為48%;Kosaka等[7-9]報道日本患者T790M基因突變率為50%-70%;Costa等[10,11]報道美國患者T790M基因突變率為44%-86%.

1.2 T790M基因突變導致耐藥的可能機制 Lynch等在2004年發現,NSCLC患者酪氨酸激酶區域存在EGFR敏感突變(19Del和L858R),EGFR-TKI可阻斷三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)結合到細胞內酪氨酸激酶結構域,因此抑制受體自身磷酸化并導致下游的信號轉導受阻,引起受體內化障礙.隨后大量的論文和綜述報道了EGFR-TKI對NSCLC治療的療效.2009年IPASS臨床試驗證實EGFR突變的患者可以從EGFR-TKI治療中獲益,盡管相比標準化療,EGFR-TKI治療患者的中位總生存期沒有明顯延長,但客觀反應率提高,PFS延長,患者生活質量明顯改善.隨后F-SIGNAL、WJTOG3405、NEJGSG002、OPTIMAL和EURTAC等大規模、多中心、隨機對照、前瞻性臨床試驗都證實了IPASS的結論[12].

2007年Sharma等[13]詳細分析了EGFR的藥物敏感基因和藥物耐藥基因突變,前者主要包括19號外顯子缺失(19Del)和21號外顯子第858氨基酸位點突變(L858R),后者主要指20號外顯子中第790氨基酸位點由蘇氨酸(T)突變為甲硫氨酸(G),即T790M,基因水平表現為ACG突變為ATG.在亞裔、女性、不吸煙、腺癌患者中EGFR基因突變率高,19Del和L858R約占突變總數的90%,T790M約為2.5%.目前研究發現T790M突變總是與其它類型EGFR基因突變共存,主要是19Del或L858R,目前未見任何報道顯示T790M突變單獨存在于肺癌組織中.由于甲硫氨酸比蘇氨酸空間占位大,因此形成空間位阻,改變了EGFR激酶區ATP的親和性,導致EGFR-TKI類小分子藥物不能有效阻斷EGFR活化信號,從而失去對腫瘤細胞殺傷作用[1,2].

由于EGFR基因突變的患者采用EGFR-TKI治療能獲益,因此EGFR野生型患者不推薦使用EGFR-TKI治療.在大多數針對T790M的研究中,入選患者也都是攜帶EGFR敏感突變并給與EGFR-TKI治療的患者.對于EGFR野生型患者,由于不推薦進行EGFR-TKI治療,因此EGFR-TKI是否會導致EGFR野生型的腫瘤發生T790M突變至今未知.

目前的共識是T790M基因突變是EGFR-TKI耐藥的重要機制之一,但T790M的出現是從無(治療前)到有(耐藥后)還是從少(治療前)到多(治療后)至今還有爭議.目前有兩種假說,即獲得性模式和選擇性模式假說來解釋此現象[14,15].獲得性模式假說認為EGFR-TKI治療前腫瘤細胞不存在de novo T790M基因突變,經過EGFR-TKI治療后腫瘤新發生了T790M基因突變.選擇性模式是指de novo T790M原本存在于極少數的腫瘤細胞中,當使用EGFRTKI治療時選擇性清除了對藥物敏感細胞后,耐藥細胞即T790M基因突變細胞存活下來并發生增殖,因此這類突變細胞是經藥物"選擇"后出現的.支持獲得性模式的證據主要依據是治療前T790M基因突變率極低 (0-2%),而耐藥腫瘤中T790M基因突變率高[3].此外,同一患者治療前腫瘤中未檢測到T790M基因突變,但治療后疾病進展的腫瘤進行再次活檢發現新增加了T790M基因突變[2].支持選擇性模式的證據是一些報道中采用敏感的檢測方法進行T790M基因突變檢測,發現EGFR-TKI-naive的腫瘤標本中de novo T790M突變并非罕見[4,5,16-18],其突變率可高達79%.其中美國麻省總醫院報道的外周血腫瘤細胞中T790M基因突變率為38%,這種無創性、可實時檢測的標本為未來研究藥物耐藥機制及應對策略提供了寶貴的生物材料資源.

2 T790M基因突變檢測方法

采用不同檢測方法得到的T790M基因突變陽性率各不相同.文獻報道的用于檢測T790M基因突變的方法包括基因擴增后直接測序法(direct sequencing, DS)、突變富集PCR法、擴增阻礙突變系統(amplification refractory mutation system, ARMS)法、蝎形探針擴增阻滯突變系統(scorpions amplif i cation refractory mutation system, SARM)法、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of fl ight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)、PCR-集落雜交法(colony hybridization, CH)和下一代測序法(next-generation sequencing,NGS)等[4,19-22].在眾多方法中,DS法的敏感性最低(表1).

表 1 文獻報道的T790M檢測方法Tab 1 Documented methods for T790M detection

采用更敏感的方法,可以提高治療前標本(非腫瘤組織和腫瘤組織)的T790M基因突變陽性檢出率.2008年Maheswaran等[17]利用CTC-chips從轉移性肺癌患者的外周血中分離出循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)后,采用SARM法檢測T790M基因突變,發現陽性率高達62.5%.采用MALDI-TOF MS法進行T790M檢測,治療前突變陽性率為25%-32%,該結果通過NGS進行了驗證.此外,MALDI-TOF MS、克隆雜交法等除了對T790M突變進行定性檢測,還可以對T790M基因突變進行半定量或定量檢測.未來通過下一代測序技術不僅可以實現定性檢測,也可以進行定量檢測;不僅可以對手術標本檢測,也可以對小標本、血液標本進行檢測;還可以實現多基因檢測.

3 T790M基因突變的臨床相關因素

3.1 與疾病分期相關 日本的Inukai等[16]檢測了280例患者,發現I期/II期患者T790M基因突變率為0.59%,而III期/IV期患者T790M基因突變率為8.1%,提示T790M基因突變與疾病分期相關,晚期患者更多出現T790M基因突變.

3.2 與腫瘤發生部位相關 Oxnard等[23]對93例帶有EGFR基因突變、經過EGFR-TKI治療復發的NSCLC患者進行二次活檢后發現,T790M基因突變的發生幾率與取材部位相關,在肺與胸膜的腫瘤組織中常見,而在肝、骨、腦、腎上腺、子宮頸、皮膚和腹膜等部位的轉移瘤中較少見;此外,T790M基因突變與性別、種族、吸煙狀況、EGFR敏感基因突變類型、TKI藥物種類及治療時間無關.Rosell等[24]檢測了EGFR-TKI治療后疾病進展的129名患者,發現45例患者治療前的腫瘤標本中存在T790M基因突變,該突變與骨轉移及EGFR敏感突變類型相關,EGFR外顯子19缺失患者多伴隨T790M基因突變.

Arcila等[25]檢測了99名對EGFR-TKI耐藥的肺癌患者,發現腦脊液、腎臟、腎上腺、子宮頸、皮膚和胸壁的腫瘤中未檢測到T790M基因突變.通過對14例標本的多處轉移灶(2個-3個)分別進行突變檢測,發現不同瘤灶間EGFR活性基因突變的一致率為100%,而T790M基因突變一致率僅為57%,提示T790M基因突變在不同部位具有更大的腫瘤異質性.

4 T790M基因突變是預測還是預后因素

4.1 是否與EGFR-TKI的療效預測相關 2012年臺灣Su等[5]采用MALDI-TOF MS檢測了76名IIIb期/IV期NSCLC患者,發現de novo T790M基因突變率為31.5%.根據EGFR基因突變狀態將患者分為3組,分別為L858R/19Del、L858R/19Del聯合T790M基因突變和以上3種突變都不存在的患者.在56例經過EGFR-TKI治療的患者中,具有de novo T790M基因突變的患者(n=23)對EGFR-TKI的應答時間明顯短于不具有T790M基因突變(n=33)的患者,他們的PFS分別為6.7個月和10.2個月,經過EGFR-TKI治療的兩組患者的中位PFS都優于無EGFR活性突變的患者.盡管在總生存期(overall survival, OS)方面三組沒有差別,但EGFR-TKI治療前T790M陽性患者應用EGFR-TKI緩解時間更短,因此該研究認為de novo T790M基因突變是EGFR-TKI療效的預測因子.Roselle等[24]也發現治療前有T790M突變和無突變患者的PFS分別為12個月和18個月(P=0.05).

Fujita等[4]則認為de novo T790M基因是否突變不預測EGFR-TKI治療療效,但突變豐度對療效有預測作用.在該研究中作者采用克隆雜交的方式將T790M基因突變分為強陽性、中度陽性和無T790M基因突變組.結果顯示,將患者按照治療前腫瘤組織中是否存在T790M基因突變分組后,突變患者的中位至治療失敗時間(time to treatment failure, ヰF)為9個月而無突變的患者是7個月,二者之間無統計學差異.將患者按突變豐度分組比較,T790M基因突變強陽性、中度陽性和無突變患者的TTF分別為41個月、7個月和7個月(P= 0.001,9).

其它一些小樣本的報道則是探討了疾病進展時T790M基因突變與EGFR-TKI療效的關系.其中來自美國的Oxnard等[26]對22例I期-III期肺腺癌患者采用吉非替尼或厄洛替尼進行新輔助或術后輔助治療,發現對EGFRTKI治療緩解時間長的NSCLC患者(TKI治療結束后疾病發生進展者)T790M基因突變率低(0%),而緩解時間短的NSCLC(TKI治療過程中疾病發生進展者)T790M基因突變率高達67%.荷蘭的Becker等[27]觀察了14例初始EGFR-TKI治療后獲得長期疾病控制的患者,這些患者經過標準化療后再次發生疾病進展,后續采用EGFR-TKI治療后,療效達到部分緩解(partial response, PR)、疾病穩定(stable disease, SD)和疾病進展(progressive disease,PD)的分別為5例、7例和2例,其中T790M基因突變者分別為2個、1個和2個,這提示在初始EGFR-TKI治療有效的患者中,再次使用EGFR-TKI治療發生耐藥的機制并不局限于T790M基因突變,可能有更多的耐藥機制參與其中.

4.2 是否與患者生存相關 有關T790M基因突變與NSCLC預后相關性的研究結果較為一致.Oxnard等[23]發現58例EGFR-TKI治療耐藥后再次活檢的患者中無基因突變患者相比攜帶T790M基因突變的患者疾病進展后的生存時間明顯延長(19個月 vs 12個月,P=0.036).Uramoto等[28]觀察了19例EGFR-TKI耐藥患者生存情況,發現存在T790M基因突變者(n=8)的5年生存率為86.7%,而無T790M基因突變者5年生存率為13.3% .EGFR-TKI治療后疾病進展的患者中,腫瘤中攜帶T790M突變者相對預后好的原因可能與多種因素相關:①攜帶T790M的EGFR基因突變細胞惰性生長;②無T790M基因突變的腫瘤中存在其它耐藥機制(MET擴增等)、患者體能狀態評分或新發病灶差異等其它臨床因素的影響;③后續治療藥物的作用(T790M基因突變患者常采用EGFR-TKI聯合化療藥物做為后續治療,而該化療藥物傾向于對耐藥腫瘤療效更好)[23].

另一項匯總6項臨床試驗的薈萃分析[29]顯示,61例等待臨床試驗入組的EGFR突變的患者中14例在藥物洗脫(TKI停藥)期間發生疾病暴發(中位時間為8天).研究發現與疾病暴發相關的因素包括EGFR-TKI治療后至疾病進展時間和治療前腦或胸膜存在轉移,但與腫瘤組織中是否具有T790M基因突變無相關性,出現疾病暴發者與無疾病暴發者T790M基因突變率分別為55%和59%.該研究所納入的患者并不是由于EGFR-TKI藥物耐藥后導致的疾病進展而是治療中斷導致的疾病進展,在這種特殊情況下疾病進展可能與T790M基因突變無關.

5 EGFR-TKI耐藥的治療策略

目前迫切需要解決的問題是,如何根據突變類型和突變豐度,在合適的時間選擇適合的人群進行有針對性的治療.Yang等[30]根據疾病控制時間、腫瘤負荷的改變和臨床癥狀等因素將EGFR-TKI治療失敗患者的疾病進展臨床模式分為快速進展、緩慢進展和局部進展,并根據不同的表現形式采取化療、繼續TKI治療和TKI聯合局部治療等不同的治療策略.此外,就分子機制而言,EGFR-TKI耐藥是多種因素共同作用的結果,這些因素包括T790M基因突變、MET擴增、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)上調、G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor, GCPR)表達及小細胞肺癌轉化等[3,9,31-33].各種機制之間還存在交叉現象,使得EGFR-TKI耐藥機制更加錯綜復雜,因此應根據主導耐藥機制和臨床因素,采取個體化治療策略,克服EGFR-TKI耐藥.

正在嘗試中的治療策略包括不可逆EGFR-TKI治療、EGFR-TKI與EGFR抗體聯合治療、使用特異性T790M抑制劑和采用非特異性抑制劑等措施.

5.1 不可逆EGFR-TKI T790M基因突變阻礙了EGFR與EGFRTKI的結合或者增加了EGFR與其配體ATP的親和力,最終無法阻斷EGFR磷酸化所介導的信號轉導而導致耐藥[34],因此不可逆性抑制EGFR可能克服繼發耐藥的產生.目前研究較多的有阿法替尼、Dacomitinib、Neratinib、XL647等.阿法替尼是EGFR和ErbB2的不可逆TKI,一項阿法替尼對比安慰劑治療吉非替尼或厄洛替尼和一、二線化療治療失敗NSCLC、隨機、IIb/III期臨床試驗結果[35]顯示,經獨立評估后的阿法替尼組PFS為3.3個月,安慰劑組為1.1個月;ORR在阿法替尼組和安慰劑組分別為7%和1%;PFS和ORR在兩組間均有統計學差異,但OS沒有明顯差異.Dacomitinib是一種不可逆抑制EGFR、HER2和HER4的TKI[36].一項Dacomitinib治療之前接受過≥1次化療并且厄洛替尼治療失敗的NSCLC患者的II期臨床研究[37]顯示,62例可評價的患者中,3例為PR,35例為SD.Neratinib是泛ErbB(EGFR、ErbB2和ErbB3)不可逆TKI,一項II期臨床試驗共入組167例晚期NSCLC患者,均接受Neratinib口服治療,其中A組為既往接受EGFRTKI治療且存在EGFR突變者,B組為既往接受EGFR-TKI治療但無EGFR突變者,C組為既往未接受EGFR-TKI治療的肺腺癌患者,三組患者的RR均為3%.XL647能不可逆性抑制EGFR、HER2、VEGFR-2和EphB4[38],研究結果顯示XL647能抑制L858R聯合T790M基因突變的腫瘤生長.一項關于XL647的II期臨床試驗[39]證明,在33例吉非替尼或厄洛替尼治療緩解超過3個月后發生疾病進展的NSCLC患者中,12例(67%)存在T790M基因突變,用XL647(300 mg/d)治療后,僅1例部分緩解,該患者不吸煙,EGFR外顯子19缺失,血漿中無T790M基因突變;而T790M基因突變陽性的患者無一緩解,大部分在2個月內進展.綜上所述,新一代的不可逆EGFR-TKI藥物有效率僅2%-7%[35,37-39],與可逆EGFR-TKI相比并沒有帶來明顯的臨床獲益.

5.2 EGFR抑制劑的聯合 不可逆EGFR-TKI藥物的療效差強人意,如果同時給予針對EGFR包膜內的小分子抑制劑和包膜外抗體的聯合治療是否可以克服T790M耐藥?2011年美國臨床腫瘤學會(American Society of Clinical Oncology, ASCO)報道了阿法替尼聯合西妥昔單抗治療EGFR基因突變的吉非替尼或厄洛替尼治療進展后的晚期NSCLC(2011 ASCO Annual Meeting, Abstract 7525)的結果,在39例存在T790M基因突變的患者中可評價療效的有35例,其中33例(94%)疾病得到控制,有效率為51%(18/35).18例T790M突變陰性的患者中可評價療效的16例,其中94%疾病得到控制,有效率為56%.該結果顯示,90%以上的EGFR-TKI耐藥患者能夠從阿法替尼聯合西妥昔單抗治療中獲益,似乎為克服耐藥提供一種較好的模式,但仍需等待最新結果公布及進一步研究證實.

5.3 TKI與MET抑制劑聯合 2007年發現MET擴增是與EGFR-TKI獲得性耐藥相關的另一機制[40].研究[6,8,9,11]發現,EGFR-TKI耐藥的NSCLC中大約有5%-33%同時存在T790M基因突變和MET擴增.同時使用EGFR和MET抑制劑可能會提高克服耐藥NSCLC的療效.Xu等[41]通過荷瘤小鼠模型(腫瘤細胞共表達T790M基因突變和MET擴增)證實單獨抑制T790M基因突變或抑制MET擴增并不能使腫瘤明顯縮小,而聯合抑制二者可以使腫瘤明顯縮小.目前研究中的針對MET擴增的抑制劑包括小分子抑制劑如ARQ197、SGX-523、XL-880、XL-184和抗MET抗體(如PF2341066、Ficlatuzumab和Rilotumumab).Sequist等[42]研究顯示,厄洛替尼聯合ARQ197組患者的中位PFS為3.8個月,而厄洛替尼聯合安慰劑組為2.6個月(危險比HR=0.81,P=0.24,校正HR=0.68,P<0.05).后續34例厄洛替尼治療失敗的患者交叉到厄洛替尼聯合ARQ197治療組,在23例可評價療效的患者中出現2例PR,9例SD.2例PR患者均有MET擴增,說明EGFR-TKIs治療失敗的患者用MET小分子抑制劑是合理的選擇.MetMAb是能特異性結合MET受體的單價單克隆抗體,2011年ASCO年會公布了OAM4558g的研究結果(2011 ASCO, Abstract 7505),MetMAb聯合特羅凱可明顯提高MET表達陽性NSCLC患者的PFS和OS,使這類患者死亡風險降低近3倍,可見TKI與MET抑制劑聯合也是值得探討的一種治療模式.

5.4 T790M特異性TKI 當不可逆EGFR-TKI并沒有達到預期的療效時,研究者開始思索是不是直接抑制T790M基因突變可行.目前針對T790M基因突變特異性的抑制劑如CO-1686、AP26113 和WZ4002正在進行臨床前和I期/II期臨床研究.CO-1686是一種口服、共價、小分子化合物,以劑量依賴的方式抑制肺癌EGFR基因突變細胞系H1975 (EGFR L858R/T790M)和 HCC827(EGFR 19DelE746-A750)的生長,目前處于I期/II期臨床研究中;AP26113(NCT01449461)是一種合成的、口服的TKI,具有抑制表達L1196M(ALK)和T790M的NSCLC的活性,該藥尚處于I期/II期臨床研究中,已發現其主要副作用是疲勞、惡心、腹瀉和肝毒性.WZ4002[43]苯胺酸骨架更適合T790M突變基因的空間構象,其與T790M突變型的親和力是與野生型的100倍,其作用機制與抑制EGFR、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)和細胞外信號調節激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK1/2)的磷酸化有關.WZ4002對含T790M基因突變的NSCLC細胞系有較高的抑制能力,在T790M基因突變肺癌鼠模型中也明顯抑制腫瘤生長,該藥目前仍處于臨床前研究中.

5.5 其它針對旁路激活途徑的藥物 熱休克蛋白90作為一種分子伴侶,有利于維持EGFR敏感突變的空間構像,應用熱休克蛋白90抑制劑可以使EGFR降解.體內和體外研究[44-46]發現熱休克蛋白90抑制劑可以使含T790M基因突變的NSCLC細胞系EGFR-PI3K-Akt-mTOR信號通路完全被抑制.目前熱休克蛋白90抑制劑AUY922與厄洛替尼聯合治療獲得性耐藥NSCLC的I期劑量爬坡研究正在進行(NCT01259089).這方面的研究似乎向我們展示了克服T790M耐藥的一種新的思路.

6 結語

綜上所述,T790M基因突變是導致EGFR-TKI耐藥的主要因素,但T790M基因突變確切耐藥機制尚不清楚.目前T790M基因突變對預后有一定的判定作用,但對EGFR-TKI療效的預測作用現有研究結果尚不一致.針對T790M基因突變的檢測方法種類繁多,如何優化檢測方法,提高檢測的敏感性和特異性,幫助臨床醫生進行治療決策,是需要深入探討的課題之一.現有的臨床實踐仍然是根據臨床特征進行耐藥后治療選擇,隨著T790M基因突變耐藥分子機制的明確,如何根據分子發生機制的不同選擇治療方案將是未來的研究熱點.