侵染廣東甘薯的甘薯曲葉病毒分子檢測與鑒定

湯亞飛， 何自福＊， 韓利芳， 羅方芳

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣州 510640； 2.廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

甘薯曲葉病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）引起的甘薯曲葉病是世界甘薯生產(chǎn)的重要病害之一，在美國［1］、西班牙［2］、巴西［3］、以色列［4］、意大利［5］、日本［6］等國家均有發(fā)生，并造成較嚴(yán)重的損失。該病毒屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）成員，基因組僅含有 DNA－A，由煙粉虱（Bemisia tabaci）以持久方式傳播［7］。SPLCV主要侵染旋花科（Convolvulaceae）番薯屬（Ipomoea）甘薯等植物，引起寄主植物葉片卷曲，導(dǎo)致產(chǎn)量損失。目前，在我國遼寧［8］、江蘇［9］、云南［10］、福建［11］、臺(tái)灣［12］等地已報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒。

甘薯（Ipomoea batatas Lam.）是重要的糧食、能源和工業(yè)原料作物之一。廣東省是我國主要的甘薯產(chǎn)區(qū)之一，年種植面積近30萬hm2。2011－2012年，作者在全省各甘薯產(chǎn)區(qū)進(jìn)行調(diào)查，先后在廣州市天河區(qū)和梅州市興寧市發(fā)現(xiàn)部分甘薯植株表現(xiàn)葉片向上卷曲、葉脈腫大等癥狀。應(yīng)用菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus 病毒通用簡并引物AV494 CoPR［13－14］進(jìn)行PCR檢測顯示，該病樣中均存在菜豆金色花葉病毒屬病毒。為了弄清該病毒的種類，進(jìn)而指導(dǎo)病害防治，本研究對其基因組進(jìn)行了克隆和序列分析。

1 材料與方法

1.1 病樣來源

在廣州市天河區(qū)和梅州市興寧市的甘薯產(chǎn)區(qū)分別采集代表性甘薯病樣10份和5份，田間病株表現(xiàn)為葉片向上卷曲，葉脈腫大等癥狀（圖1）。

圖1 田間甘薯曲葉病癥狀Fig.1 The symptoms of sweet potato leaf curl disease

1.2 病株總DNA提取

利用CTAB方法［15］提取甘薯病葉組織的總DNA。

1.3 PCR檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡并引物AV494／CoPR［13－14］，對病樣進(jìn)行PCR檢測。

1.4 RCA擴(kuò)增及酶切分析

以提取的病樣總DNA 1.0μL為模板，利用TempliphiTMRCA Kit（GE Healthcare）進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA），具 體 方 法 按照試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行。

RCA 反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Pst I、Sac I和Nde I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為：RCA產(chǎn)物2μL、內(nèi)切酶1μL、10×內(nèi)切酶緩沖液1μL，總酶切反應(yīng)體系為10μL。在37℃條件下酶切2h以上，然后進(jìn)行電泳分析。若某個(gè)內(nèi)切酶酶切的產(chǎn)物產(chǎn)生2.5～3.0kb，或同時(shí)還產(chǎn)生1.3kb左右的條帶，則克隆這些特異性條帶。

1.5 序列分析

利用 DNAStar軟 件 （DNASTAR Inc，Madison，USA）進(jìn)行序列拼接，利用BLAST程序進(jìn)行序列相似性搜索，進(jìn)一步用DNAStar的 MegAlign進(jìn)行序列比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病樣PCR檢測結(jié)果

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物AV494和CoPR進(jìn)行PCR檢測，從所有表現(xiàn)為曲葉癥狀的甘薯病樣總DNA中均能擴(kuò)增到一條預(yù)期大小為570bp的特異片段，而健康植株未擴(kuò)增出任何片段。該結(jié)果表明，這些病樣受到菜豆金色花葉病毒屬病毒的侵染。

2.2 RCA產(chǎn)物酶切結(jié)果

隨機(jī)挑取PCR檢測為陽性的廣州市病樣2份及梅州市興寧市病樣1份，以其總DNA為模板進(jìn)行RCA擴(kuò)增，酶切結(jié)果顯示，Pst I、Sac I、Nde I等3個(gè)內(nèi)切酶均能將3個(gè)RCA產(chǎn)物分別切出一條約2.7kb大小的單一條帶（圖2），推測其可能是病毒基因組的全長組分A或B。為此，對該片段進(jìn)行克隆，并分別隨機(jī)挑選3個(gè)克隆進(jìn)行測序。

圖2 甘薯病樣總DNA RCA產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RCA products of DNA extracted from diseased samples digested by restriction enzymes

2.3 序列比較分析結(jié)果

基因克隆與序列測定結(jié)果表明，廣州市甘薯病樣GZ01病毒分離物（GenBank登錄號為：JX286653）和GZ02病毒分離物（GenBank登錄號為：JX286654）的全長均為2829nt，兩者的同源率為97.3%；興寧市甘薯病樣XN01病毒分離物（GenBank登錄號為：JX286655）全長為2828nt，與GZ01的同源率為98.4%，與GZ02的同源率為96.0%。

3個(gè)病毒分離物的全長基因序列均具有單組分菜豆金色花葉病毒基因組DNA－A典型特征，為單鏈閉合環(huán)狀，推導(dǎo)編碼6個(gè)ORFs。GZ01和GZ02基因組病毒含AV1基因 （295～1059nt，編碼CP）和AV2基因 （72～470nt，編碼與病毒移動(dòng)相關(guān)蛋白），互補(bǔ)鏈含有AC1基因（1581～2675nt，編碼復(fù)制酶）、AC2基因（1226～1672nt，轉(zhuǎn)錄激活蛋白）和AC3基因（1075～1509nt編碼復(fù)制增強(qiáng)蛋白）和 AC4基因（2261～2518nt）。在 AV2與 AC1之間含有一個(gè)225nt的非編碼區(qū)（2676～71nt），含有與雙生病毒復(fù)制起始有關(guān)的保守序列TAATATTAC（2823～2nt）。病毒分離物XN01基因組結(jié)構(gòu)除了在AV2與AC1之間非編碼區(qū)的44nt處缺失一個(gè)堿基A外，其他與GZ01、GZ02的基因組結(jié)構(gòu)特征相同。

BLAST結(jié)果顯示，與廣東3個(gè)分離物DNA－A有較高同源率的序列均屬Begomovirus病毒分離物基因組。進(jìn)一步比較結(jié)果（表1）顯示，與來自西班牙、美國、韓國、日本、阿根廷及中國等19個(gè)分離物的序列同源率均在89.0%以上，其中GZ01與美國MS：1B－1a、MS：4B－14分離物同源率最高（94.5%），而GZ02和XN01與F－p1、F－p2、F－p3這3個(gè)分離物的同源率最高，分別為95.9%和94.3%。

表1 SPLCV 3個(gè)廣東分離物與已報(bào)道的19個(gè)分離物DNA－A核苷酸序列同源率比較Table 1 Percentages of DNA－A nucleotide sequences identities between the 3 isolates from Guangdong and 19isolates of SPLCV previously reported

3 討論

甘薯曲葉病是近年在廣東甘薯上發(fā)現(xiàn)的一種新病害，通過PCR檢測證明這些病樣中均存在菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）病毒，進(jìn)一步應(yīng)用RCA方法從病樣中獲得3個(gè)病毒分離物DNA－A全長序列。這些病毒分離物DNA－A具有菜豆金色花葉病毒屬成員基因組DNA典型特征，且與已登陸GenBank中SPLCV各分離物的序列同源率均在89%以上，其中與F－p1、F－p2和F－p3這3個(gè)分離物的同源率均在94.3%以上。因此，根據(jù)目前國際雙生病毒分類方案［16］，侵染廣東甘薯的病毒分離物GZ01、GZ02和XN01均屬于SPLCV。

采用RCA及PCR方法，在廣東甘薯病樣中均未檢測到DNA－B組分和衛(wèi)星分子的存在。同時(shí)，目前國內(nèi)外已報(bào)道的SPLCV各分離物基因組均只含有DNA－A組分。因此，推測侵染廣東甘薯的SPLCV也是一個(gè)單組分Begomovirus病毒。

雖然GZ01、GZ02和XN01這3個(gè)分離物均分離自廣東甘薯上，但其DNA－A序列存在不同程度的差異，同源率為96.0%～98.4%；即使來自同一塊甘薯地的分離物GZ01和GZ02，兩者序列也存在一定差異（同源率為97.3%）。說明侵染廣東甘薯的SPLCV種群存在遺傳差異。關(guān)于這3個(gè)病毒分離物的致病性及其遺傳變異的生物學(xué)意義，還有待于通過構(gòu)建侵染性克隆接種來進(jìn)一步研究。

近年來，煙粉虱傳播的雙生病毒病在我國廣泛流行，其中番茄黃化曲葉病最為普遍，而在廣東及華南地區(qū)雙生病毒種類較多，目前至少發(fā)現(xiàn)有14種，受害植物種包括番茄［14］、番木瓜［17］、黃秋葵［18］、朱槿［19］、鱧腸［20］、軟枝黃蟬［21］、棉花［22］等作物。2012年，本研究團(tuán)隊(duì)先后在廣東省廣州市和梅州市興寧市等甘薯產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)甘薯曲葉病，并從中檢測與鑒定出甘薯曲葉病毒。這是首次在廣東檢測到該病毒。因此，應(yīng)采取有效防治措施，預(yù)防與控制甘薯曲葉病毒傳播、擴(kuò)散和流行。

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