內生短短芽胞桿菌011菌發酵濾液抑菌活性研究

王宇婷， 易有金，2，3＊， 夏 菠， 楊建奎， 曾 靜

（1.湖南農業大學食品科學技術學院，長沙 410128；2.湖南省食品科學與生物技術重點實驗室，長沙 410128；3.湖南省發酵工程技術中心，長沙 410128；4.湖南農業大學理學院，長沙 410128；

5.湖南農業大學園藝園林學院，長沙 410128）

植物內生菌是一類寄生于健康植物組織內的微生物類群，至今被研究過的不到15%［1］。近幾年的研究表明，植物內生菌代謝產物中許多具有抗菌活性。Arunachalam等［2］從穿心蓮健康葉中分離出20株內生細菌，8株具有抗菌活性；Gayathri等［3］從5種紅樹屬植物葉中分離到的104株內生細菌中36株具有生物活性，而其中28株具有抗菌活性。80%的內生真菌具有抗真菌、抗雜草或抗藻類活性，而來自土壤中的真菌大約只有43%具有抗菌活性［4］。許多內生菌抗菌活性物質是未開發的新物質［4］，據統計，植物內生真菌中發現新化合物的比例為51%，而土壤微生物僅有38%［5］。隨著病原菌耐藥性的出現，人們渴望開發出新的抗菌藥物。對內生菌這一抗菌活性物質來源新領域的研究將具有十分重大的意義。

從煙草植物組織中分離得到一株內生拮抗細菌011，經鑒定其為短短芽胞桿菌［Brevibacillus brevis（Migula）Shida et al.］，GenBank登錄號為DQ444285［6］。前期研究結果表明，011菌對煙草青枯病具有良好的防治效果，室內和田間防治效果分別達到87.25%和82.23%［6］。為進一步明確該菌產生的抗菌活性物質，并擴大其在生物防治上的應用，本研究對011菌發酵濾液抑菌譜進行測定，并顯微觀察其對番茄早疫病菌菌絲及孢子抑制作用。011菌發酵濾液對番茄早疫病菌最低抑菌濃度、有效中濃度及其抗菌活性穩定性的測定，為開發新型生物防治劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

內生短短芽胞桿菌011菌株由湖南省食品科學與生物技術重點實驗室分離、鑒定與保存。番茄早疫病菌［Alternaria solani （Ellis et Martin）Sorauer］、白菜黑斑病菌［A.brassicae （Berk.）Sacc.］、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorumLib.）、黃瓜炭疽病菌［Colletotrichum lagenarium （Pass.）Ell.and Halst.］、辣椒疫病菌（Phytophthora capsici Leonlan）、辣椒炭疽病菌［Colletotrichum capsici （Syd.）Butl.et Bisby］、柑 橘 炭 疽 病 菌 ［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］、黃 瓜 枯 萎 病 菌（Fusarium oxysporumSchl.），供試病原菌株均由湖南農業大學植物病理實驗室提供。

1.1.2 培養基

BPY液體培養基、PDA固體培養基［7］。

1.2 方法

1.2.1 內生短短芽胞桿菌011菌發酵濾液制備

種子液制備：將斜面保存的011菌株接入BPY培養液中，裝液量100mL／250mL、初始pH7.0、30℃、180r／min振蕩培養24h。

發酵培養：以1%接種量將種子液接種到BPY發酵培養基中，裝液量100mL／250mL、初始pH7.0、30℃、180r／min振蕩培養48h。

發酵液處理：011菌液體培養物于10000r／min離心10min，上清液經孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，得到含有抑菌活性物質的發酵濾液。

1.2.2 平皿打孔法檢測抗菌活性

將病原真菌接種于PDA固體培養基中央，28℃下培養24h后在新長成的菌絲周圍打孔（d＝6mm），將待測活性物質注入孔內，每孔100μL，用未接菌的BPY液體培養基作空白對照，28℃培養48h，觀察抑菌狀況及抑菌帶寬度［8］。

1.2.3 抗菌譜測定

采用平皿打孔法測定011菌發酵濾液對8種植物病原真菌的抑菌作用，以未接菌的BPY液體培養基作對照，每處理3次重復。

1.2.4 011菌發酵濾液對番茄早疫病菌菌絲的影響

挑取平皿打孔法抗菌活性測定中抑菌帶邊緣的番茄早疫病菌菌絲，鏡檢觀察菌絲形態［9］，每處理3次重復。

1.2.5 011菌發酵濾液對番茄早疫病菌孢子萌發的影響

將番茄早疫病菌于PDA上培養一定時間后使其產孢，用少量無菌水將病菌孢子洗下來，加無菌水稀釋到40倍物鏡下每視野中40個孢子。取上述配制的孢子懸浮液加入等體積011菌發酵濾液混均，以加無菌水為對照，取10μL滴加于凹玻片上。28℃保濕培養24h，顯微鏡下取中間及四周5個視野觀察孢子形態，并記錄每個視野中孢子總數及萌發數。孢子芽管長度大于孢子直徑視為萌發。

1.2.6 MIC及EC50測定

取不同濃度011菌發酵濾液100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%，加入等體積番茄早疫病菌孢子懸浮液，使011菌發酵濾液終濃度為50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%，按1.2.5觀察孢子萌發情況，每處理3次重復。計算孢子萌發抑制率，求出最低抑菌濃度MIC。在MIC之下，將抑菌的百分率轉換成幾率值，濃度轉換成對數，通過回歸分析求得抑制萌發的有效中濃度（EC50）。

1.2.7 011菌發酵濾液抗菌活性穩定性測定

熱穩定性：將011菌發酵濾液分別于60、70、80、90、100℃水浴中保溫1h，以未經處理的發酵濾液為對照。酸堿穩定性：用0.1mol／L的 HCl及0.1mol／L的NaOH溶液將011菌發酵濾液分別調pH 至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，室溫放置12h，將pH調回7.0定容至相同體積。紫外光穩定性：將發酵濾液于20W紫外燈下分別照射（照射距離30cm）30、60、90、120min，以未經紫外光照射的發酵濾液作對照，每處理3次重復。以番茄早疫病菌為指示菌，按1.2.2方法檢測抗菌活性。

1.2.8 數據分析

采用SAS軟件對數據進行差異顯著性分析（Duncan多重比較分析差異性顯著性法P＝0.05）。回歸分析由Microsoft Excel完成。

2 結果與分析

2.1 抗菌譜

011菌發酵濾液抗菌譜顯示，該菌株發酵濾液對多種植物病原真菌具有抑制作用，抑菌帶寬度見表1，011菌株發酵濾液對番茄早疫病菌抑菌帶寬度最大（圖1），為5.5mm，拮抗能力最強；對柑橘炭疽病菌抑菌帶寬度最小（圖2），為2.1mm，拮抗能力最弱。

表1 011菌株發酵液對植物病原真菌的拮抗作用Table 1 Antibiotic effects of the ferments of the strain 011 on plant fungal pathogens

圖1 011菌株對番茄早疫病菌的抑制作用Fig.1 The inhibition zone of the strain 011against A.solani

圖2 011菌株對柑橘炭疽病菌的抑制作用Fig.2 The inhibition zone of the strain 011 against Colletotrichum gloeosporioides

2.2 對番茄早疫病菌菌絲形態的影響

011菌發酵濾液對番茄早疫病菌菌絲生長及菌絲形態有明顯影響，在發酵濾液邊緣處，病原菌菌絲不能向外生長，形成一條抑菌條帶（圖1）。挑取抑菌帶邊緣的番茄早疫病菌菌絲鏡檢發現，番茄早疫病菌菌絲生長異常，菌絲細胞畸形，菌絲節間變短變粗，粗細不均勻，細胞原生質收縮，出現空泡（如圖3a）。正常菌絲光滑，透明，粗細均勻，原生質分布均勻（如圖3b）。

圖3 011菌株發酵液對番茄早疫病菌菌絲的作用（40×）Fig.3 Antagonism of the strain 011against the mycelia of A.solani

2.3 對番茄早疫病菌孢子萌發影響

采用孢子萌發法，將番茄早疫病菌孢子懸浮液培養24h后，40×顯微鏡下觀察，對照組孢子形成細長、光滑、均勻的芽管（圖4c）。高濃度011菌發酵濾液使孢子發芽點處出現囊泡（圖4a），從而完全抑制孢子萌發。低濃度011菌發酵濾液使芽管畸形，中間或頂端膨大，或成串珠狀（圖4b），而且受抑制的孢子芽管長度明顯也小于對照組。

圖4 011菌株發酵液對番茄早疫病菌孢子萌發影響（40×）Fig.4 Effects of the ferment of the strain 011on spore germination of A.solani（40×）

2.4 MIC及EC50

由表1可知，經不同濃度011菌發酵濾液處理后，番茄早疫病菌孢子萌發均受到不同程度抑制。當濃度大于30%時，孢子萌發完全被抑制，即011菌發酵濾液對番茄早疫病菌孢子萌發MIC為30%。當發酵濾液濃度小于30%時，不同處理間的孢子萌發抑制率表現出顯著差異（表2），通過回歸分析所得毒力方程：Y＝3.4263 X＋8.4459，相關系數R＝0.9992；經計算知其抑制番茄早疫病菌孢子萌發有效中濃度EC50為9.87%。

表2 011菌株發酵液對番茄早疫病菌孢子萌發抑制作用Table 2 Inhibition of A.solani spore germination by the ferment of the strain 011

2.5 011菌發酵濾液活性穩定性

由圖5可知，溫度對發酵濾液抑菌活性影響不大。100℃處理1h抑菌帶寬度為5.28mm，為對照（未處理的發酵濾液）抑菌帶寬度5.53mm的95.48%，表明發酵濾液中抗菌活性物質對高溫具有較好的耐受性。

由圖6可知，發酵濾液在酸性條件下有較好的穩定性，pH2.0抑菌帶寬度與pH7.0沒有明顯差異，說明酸性條件對抗菌物質穩定性沒有影響。但發酵濾液對堿不穩定，pH7.0抑菌帶寬度5.30mm，隨著pH的升高抗菌活性顯著降低，pH8.0抑菌帶寬度為4.61mm，pH10.0抑菌帶寬度降為2.71mm。

經紫外光照射不同時間后，結果見圖7，其抑菌帶寬度與對照（未處理發酵濾液）相比無明顯變化，說明該發酵濾液對紫外光不敏感。

圖7 不同紫外光照射時間對發酵濾液活性的影響Fig.7 Effects of different UV exposure times on the activity of the culture filtrates of the strain 011

3 討論

植物內生菌因其在植物體內占據有利生態位點而定殖、誘導植物產生抗性、與植物形成協同關系、產生抗菌活性物質［10］，是一種較為理想的生防微生物，內生菌用于田間防治及果蔬保鮮已有報道［11－14］。本試驗研究了植物內生菌011菌發酵濾液的抑菌活性，表明011菌株產生抗菌活性物質抑制植物病原菌生長是其作為生防菌的一重要作用機理。抑菌譜測試其對白菜黑斑病菌、油菜菌核病菌、黃瓜炭疽病菌、辣椒疫病菌、辣椒炭疽病菌、柑橘炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌多種植物病原菌均有抑制效果，011菌發酵濾液有望開發成生物農藥來防治農作物病原真菌。但本試驗還沒解決是什么物質起抗菌作用，因此對該菌株發酵濾液的成分還有待深入探索。到目前為止，已有大量研究報道內生菌產生種類繁多的抗菌活性物質，如生物堿、抗菌肽、酚類、萜類、醌類、幾丁質酶及揮發性物質等［15］。

顯微觀察011菌發酵濾液對番茄早疫病菌的抑制作用，發現其使番茄早疫病菌菌絲節間變短變粗，扭曲變形，細胞原生質收縮，出現空泡，使菌絲不能正常生長。這可能是由于活性物質作用于病原菌的細胞膜，造成細胞膜破裂而引起的，有此類現象的抗生素很多，研究清楚的為多烯類抗生素。多烯類抗生素通過與質膜中含有的麥角醇作用損傷細胞質膜造成細胞內物質泄漏［16］。高濃度發酵濾液使番茄早疫病菌孢子出芽點處產生囊泡，而完全抑制芽管生長，低濃度發酵濾液使芽管膨大，而不能正常生長，這與王艷紅等［17］報道溫郁金內生真菌L18對玉米彎孢葉斑病菌孢子萌發的作用一致。微生物通過分泌一種或多種抗菌物質，作用于病原菌的細胞壁、細胞膜、蛋白質合成系統、能量代謝系統、細胞分裂等，可直接抑制或殺死病原菌［18］。有報道殺稻瘟菌素－S通過抑制孢子和菌絲的呼吸作用而強烈抑制孢子萌發和菌絲生長［19］。但011菌發酵濾液的作用位點還有待進一步研究。

拮抗菌制劑的效果與拮抗菌制劑的發酵工藝、制備方法等有著密切的關系［20］。測定011菌發酵濾液對番茄早疫病菌孢子萌發最低抑菌濃度MIC為30%、有效中濃度EC50為9.87%；穩定性測定表明011菌株產生的具有抗菌活性次生代謝產物，其結構在高溫及酸性環境下穩定，在堿性環境中不穩定，且其結構對紫外線不敏感，這為拮抗菌制劑開發及制備提供依據。

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