杏采后病害病原拮抗菌的分離篩選及鑒定

鄭 琪， 徐秉良， 薛應鈺， 梁巧蘭， 張 瑾

（甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅省草業(yè)工程實驗室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070）

杏（Armeniaca vulgaris Lam.）屬肉質多汁果實，成熟期集中，采摘后不耐貯藏，極易受到病原菌侵染而發(fā)生采后病害，造成的腐爛率高達50%［1］。由細交鏈孢（Alternaria tenuis Nees）引起的黑斑病和灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）引起的灰霉病是杏采后貯藏期間的主要病害［2－3］。國內外防治果實采后病害的方法主要有：低溫貯藏、氣調貯藏、熱處理以及化學藥劑處理等，但物理方法成本高，儀器設備復雜，化學防治使病原菌抗藥性增加，果品農藥殘留危害人體健康。自Pusey［4］首次使用B.subtilis防治桃褐腐病以來，生物防治以其安全、無殘毒、無污染、不易產生抗藥性的特點逐漸成為一種控制果蔬采后病害的新途徑被人們所重視。國內外已有報道從蘋果、草莓、柑橘、油桃等水果上篩選到幾十種拮抗菌防治采后病害［5］，但利用拮抗菌防治杏采后病害的報道卻很少。因此，本試驗從生物防治角度出發(fā)，旨在從杏果實表面、葉片及根際土壤中分離篩選出對細交鏈孢和灰葡萄孢具有明顯拮抗作用的菌株，為杏采后病害的生物防治打下基礎，以延長果實的貯藏期。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇剛采摘的大小一致的成熟健康杏果實，放置于貯藏室（25℃）內。PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基參照方中達［6］的方法制備。

1.2 方法

1.2.1 杏采后病害病原菌的分離及致病性測定

采用常規(guī)的組織分離法［6］，分別對貯藏后7、9、11、13d的發(fā)病杏果實進行病原菌的分離，并計算分離頻率。初次分離后的菌種采用單孢分離法進行純化，并將純化后的菌株保存在PDA斜面上備用。采用刺傷接種和無傷接種的方法［7］，對病原菌進行致病性測定。

1.2.2 拮抗菌的分離

1.2.2.1 土壤稀釋分離法

參照徐雪蓮［8］的方法，土壤采自甘肅農業(yè)大學杏園，除去果樹根際表層5cm左右的浮土，取5～10cm處的土壤，帶回實驗室風干、過篩、混勻，每份土樣稱取10g，置于90mL無菌水中，加入小玻璃珠，在150r／min的搖床上振蕩30min，制成土壤懸浮液，用梯度稀釋法稀釋到1×10－4、1×10－5、1×10－6、1×10－7后涂布于 NA平板上，30℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2～3d，記錄菌株生長情況，然后挑取菌落形態(tài)差異明顯的單個菌落純化培養(yǎng)。

1.2.2.2 果實及植物表面拮抗菌的分離

參照Janisiewicz［9］的方法，將杏樹葉片及果實表皮分別置于0.05mol／L磷酸緩沖液中，100r／min搖床振蕩10min，將洗液梯度稀釋為1×10－1、1×10－2、1×10－3后，在 NA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株生長情況，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單個菌落純化培養(yǎng)。

1.2.2.3 杏果實傷口處拮抗菌的分離

按照Wilson等［10］的方法分離，選取10個杏果實，在每個果實的陰陽面各刺一個3mm×5mm的傷口，再用150mL無菌水分別沖洗10個無傷口的杏健康果實2次，取50μL洗液接種在傷口內，2h后接種20μL 1.0×104個／mL的病原菌孢子懸浮液，25℃、相對濕度RH＜95%條件下貯藏5d后，切取未侵染的傷口組織，在10mL無菌水中研磨均勻，取研磨液用稀釋平板法分離獲得單個菌落，純化培養(yǎng)。

1.2.3 杏采后病害病原拮抗菌的篩選

1.2.3.1 離體篩選

采用PDA 平板對峙法［11］，在平板（90mm）中央分別點接A.tenuis和B.cinerea（d＝5mm）為指示菌，將已分離純化的菌株分別點接在距離指示菌3cm處的4個角點上，以不接拮抗菌株的為對照，28℃恒溫箱培養(yǎng)5～7d，觀察記錄，選取對病原菌有較強抑制作用的菌株進行復篩，比較抑制效果R值的大小，篩選出抑菌效果好的菌株。每處理4次重復。計算公式如下：

1.2.3.2 活體篩選

參照班兆軍［5］的方法，選擇剛采摘的大小一致的成熟健康杏果實，用2%的NaClO溶液消毒2min，然后用無菌水沖洗掉殘余的NaClO后自然晾干。在果實腰部刺一個直徑3mm，深3mm的孔，先接種1×108cfu／mL拮抗菌菌懸液30μL，2h后再接種1×104個／mL病原菌孢子懸浮液30μL，對照組加入無菌水和對應的病原菌孢子懸浮液；待果實風干后置于果品周轉箱中，用保鮮膜進行密封，以保持95%左右的相對濕度，20℃貯藏5d后統(tǒng)計果實的發(fā)病率與病斑直徑。每處理10個果實，重復3次。

1.2.4 杏采后病害病原拮抗菌的鑒定

1.2.4.1 拮抗菌的培養(yǎng)特征及形態(tài)特征

參照沈萍等［12］的方法，觀察拮抗菌在NA培養(yǎng)基上的生長特征及顯微形態(tài)特征。

1.2.4.2 拮抗菌的生理生化特征

按照《伯杰細菌鑒定手冊》［13］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［14］對拮抗作用較好的拮抗菌進行相關生理生化指標的測定。

1.2.4.3 16SrDNA序列測定及分析

以細菌基因組柱式提取試劑盒提取的基因組DNA為模板，以Primer1－F5′－ATCCTTGTTACGACTTGA－3′和Primer1－R：5′－AGTTTGATCCTGGCTCA－3′為引物，進行擴增。PCR反應體系為50μL：模板DNA1μL，Primer1－F和Primer1－R各1μL，滅菌的雙蒸水22μL，Premix Taq 25μL。反應條件為：95℃初始變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃復性15min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測結果送交上海生工生物工程有限公司進行測序，將測序結果在Gen－Bank上進行同源性比對，參比序列，并利用軟件DNAStar進行聚類分析，構建同源性樹。

2 結果與分析

2.1 杏采后病害病原菌及拮抗菌的分離

2.1.1 杏采后病害病原菌的分離

通過對不同貯藏時期的發(fā)病杏果進行分離發(fā)現(xiàn)，細交鏈孢和灰葡萄孢的分離頻率最高，分別為39.7%和31.9%，在貯藏7～13d的病果上均可分離到，黑根霉在貯藏13d的果實上分離頻率也較高，平均分離頻率為18.2%，指狀青霉、粉紅聚端孢霉和黑曲霉的平均分離頻率分別為6.0%、3.4%和0.9%（表1）。

表1 不同貯藏時期發(fā)病杏果病原菌的分離頻率Table 1 The isolation frequencies of pathogens on the apricot fruits during different storage periods

經(jīng)柯赫氏法則驗證，確定A.tenuis和B.cinerea為杏采后貯藏期間的主要致病菌。

2.1.2 杏采后病害病原拮抗菌的分離

通過土壤分離法、表面分離法和組織分離法，共從采集的土樣、果實及葉片上分離到107個菌株。將107個菌株分別對A.tenuis和B.cinerea進行抑菌試驗，篩選抑菌帶大于5mm，抑菌效果明顯的菌株。結果表明，在所分離到的全部菌株中，對A.tenuis表現(xiàn)明顯抑制作用的菌株共44株，占總分離數(shù)的41.1%，對B.cinerea具有明顯抑制作用的菌株共有27株，占分離總數(shù)的25.2%；而同時對這兩種病原菌具有抑制效果的菌株僅有14株，占分離總數(shù)的13.5%（表2）。

表2 拮抗菌株的分離結果Table 2 The isolation results of antagonistic bacteria

2.2 杏采后病害病原拮抗菌的篩選

2.2.1 離體篩選

將這14株拮抗菌分別編號為JK－1～JK－14，進行離體篩選，比較R的大小，結果表明，14株菌對兩種采后病原菌均有不同程度的抑制作用，尤其以JK－14和JK－11的拮抗作用最顯著，對A.tenuis的抑制效果R分別為0.74、0.68，拮抗效果最差的是JK－1，R 為0.56，對B.cinerea的抑制效果分別達到0.74、0.73，JK－7的拮抗效果最差，R為0.38。方差分析結果表明，JK－14和JK－11間無顯著差異，而與JK－1、JK－7形成顯著差異，其余菌株的拮抗效果介于之間（表3）。

2.2.2 活體篩選

將離體篩選效果較好的2株拮抗菌分別對杏果進行活體防效試驗，結果表明，2株拮抗菌對A.tenuis和B.cinerea均表現(xiàn)出了較高的防效，且JK－14的防效優(yōu)于JK－11。經(jīng)JK－14和JK－11處理5d后的杏果，其A.tenuis的發(fā)病率分別為16.3%和19.3%，病斑直徑分別為4.4、4.7mm，而對照的發(fā)病率為95.6%，病斑直徑為12.5mm，兩者存在顯著差異。JK－14和JK－11處理杏果5d后B.cinerea的發(fā)病率分別為14.1%和17.0%，病斑直徑分別為3.2、3.4mm，而對照杏果 B.cinerea 的發(fā)病率為96.3%，病斑直徑為14.9mm，顯著高于處理果實（表4），而且對照果實已出現(xiàn)軟化、局部腐爛等癥狀，在傷口處有明顯病斑形成（圖2）

表3 14株拮抗菌株對2種病原菌的拮抗性能Table 3 Antagonistic activity of 14bacteria to 2pathogens mm

圖1 2株拮抗菌對鏈格孢菌和灰葡萄孢菌的拮抗作用（7d）Fig.1 Antibacterial effects of 2antagonistic bacterial strains on A.tenuis and B.cinerea（7d）

表4 2株拮抗菌株的活體抑制效果Table 4 In vivo inhibitory effects of 2antagonistic bacterial strains

2.3 拮抗菌的鑒定

2.3.1 拮抗菌的形態(tài)特征及理化測定

JK－14和JK－11在NA培養(yǎng)基上生長良好，28℃下培養(yǎng)2～3d即可出現(xiàn)明顯菌落，其中JK－14的菌落呈橢圓形或不規(guī)則形，乳白偏黃色，菌落不透明，表面粗糙有褶皺，革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀，大小約為0.8μm×2.5μm。JK－11菌落呈現(xiàn)圓形，白色略透明，表面光滑，菌體桿狀，大小為0.9μm×3.2μm，革蘭氏染色陽性（圖3）。2株拮抗菌的相關生理生化指標測定結果見表5。

圖2 兩株拮抗菌對杏果實上細交鏈孢（A.tenuis）灰葡萄孢（B.cinerea）的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of 2antagonistic bacterial strains on A.tenuis and B.cinereain apricot

圖3 兩株拮抗菌的菌體形態(tài)（光學顯微鏡100倍）Fig.3 Morphological characteristics of the thalli of the strain JK－14and JK－11

2.3.2 拮抗菌的分子生物學鑒定

通過對2株拮抗菌進行DNA提取及PCR擴增，對PCR產物純化后測序，得到JK－14的16SrDNA 的序列長度為1442bp，JK－11的16SrDNA 的序列長度為1437bp，2株拮抗菌的PCR產物電泳檢測結果見圖4。

表5 拮抗菌株JK－14和JK－11的生理生化鑒定結果Table 5 Physiological and biochemical properties of the strain JK－14and JK－11

圖4 JK－14、JK－11的PCR擴增產物電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of PCR amplification product of JK－14and JK－11

將條帶回收測序后在GenBank上進行比對，選取同源性不低于99%的序列，利用DNAStar軟件繪制其聚類圖譜（圖5），結果表明：JK－14與多株Bacillus的16SrDNA序列具有很高的同源性，與B.subtilis（HQ317149）、B.subtilis（JQ308571）、B.amyloliquefaciens（HQ179100）的 親 緣 關 系 最近，位于聚類圖的同一分支，聚為一類；而與JK－11同源性較高的菌株均屬Paenibacillus，與親緣關系較 近 的 菌 株P.polymyxa（AY302439）、P.polymyxa（FJ940900）和P.polymyxa（EF620470）為同一分支，聚為一類，結合生理生化測定的結果，確定JK－14為芽胞桿菌（Bacillus sp. JK－11為類芽胞桿菌（Paenibacillus sp.

圖5 菌株JK－14、JK－11的遺傳聚類分析圖譜Fig.5 Phylogenetic tree of the isolates JK－14and JK－11

3 結論與討論

杏采后病害是制約其生產和銷售的重要因素，曹建康［2］對引起杏采后黑斑病病原菌鏈格孢進行了侵染時期、機制、防治時期的研究。張瑾［1］對杏采后病害病原菌進行了分離，其中鏈格孢和灰葡萄孢對杏果均有一定的致病性。朱子華［3］報道了引起核果類桃、杏、李、櫻桃采后病害的病原菌，主要有果生鏈核盤菌（Monilinia fructicola），灰葡萄孢（B.cinerea），鏈格孢（A.tenuis）和黑根霉（R.stolonifer）等。本試驗通過對杏貯藏7～13d的病原菌進行分離，結果表明，A.tenuis和B.cinerea為杏采后貯藏期間的主要病原菌，并針對這兩種主要病原菌在杏果園土壤、果實表面及葉片中進行了拮抗菌的大量分離，共得到14株對A.tenuis和B.cinerea都具有抑制作用的菌株，占分離總數(shù)的13.5%。通過離體和活體篩選，得到兩株拮抗作用較好的菌株JK－14和JK－11，對A.tenuis的抑菌比值 R 分別為0.74和0.68，對B.cinerea的抑菌比值為0.74和0.73。處理杏果A.tenuis的發(fā)病率為16.3%和19.3%，病斑直徑為4.4和4.7mm，接種B.cinerea的發(fā)病率為14.1% 和17.0%，病斑直徑分別為3.2和3.4mm，均明顯低于對照果實的發(fā)病率和病斑直徑。雖然圍繞杏果不同生境進行了拮抗菌的大量分離篩選，得到了對其采后病害具有不同程度抑制作用的菌株，然而，對兩種病原菌同時具有明顯抑制效果的菌種卻相對較少，因此，今后還可以從更廣泛的不同生境中進行分離篩選，以擴大拮抗菌的篩選源。

JK－14和JK－11對杏果實采后病原菌A.tenuis和B.cinerea具有顯著的抑制效果，是較好的生防菌株。通過形態(tài)學，生理生化及分子生物學方法對這兩株拮抗菌進行了鑒定，結果為JK－14屬芽胞桿菌（Bacillus sp.），JK－11為類芽胞桿菌（Paenibacillus sp.）。由于Bacillus和Paenibacillus部分種之間的同源性很高，難以通過16SrDNA序列分析和生化特征予以區(qū)分。因此，還應結合gyrA、gyrB基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，對兩株拮抗菌進行進一步鑒定。

關于拮抗菌防治果蔬病害已有大量報道，楊振［15］將分離出的枯草芽胞桿菌BS－331防治油桃果實采后綠霉病和軟腐病，效果較好；陳浩等［16］發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌B－FS01對葡萄霜霉病的防效顯著；多黏類芽胞桿菌作為一種潛在的，有價值的生防菌株也逐漸受到人們關注，陳文俊［17］等報道從西瓜根際分離出的多黏類芽胞桿菌，對番茄早疫病菌、草莓炭疽病等病原菌均具有明顯的抑菌作用。但利用拮抗菌防治杏采后病害卻很少有報道。本試驗篩選出的這兩株拮抗菌對杏采后主要病害防治效果顯著，具有很好的應用和發(fā)展前景。因而，有必要對其防腐抑菌機理進行進一步的研究。

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