馬鈴薯炭疽病菌的生物學特性及培養性狀研究

楊成德， 陳秀蓉＊， 姜紅霞， 薛 莉， 蒲崇建， 張正偉

（1.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅省草業工程實驗室中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，蘭州 730020）

馬鈴薯（Solanum tuberosumLinn.）的種植幾乎遍及全球，一方面解決了糧食短缺問題，另一方面也帶來了巨大的經濟效益。據聯合國糧農組織（FAO）統計，馬鈴薯總產量在全世界所有糧食作物中位于第四，國內內蒙古、東北三省及甘肅等地區均有大面積種植。新鮮馬鈴薯中含有淀粉、蛋白質、脂肪和粗纖維，且含有禾谷類糧食所沒有的胡蘿卜素和抗壞血酸等，可作主食，也可作為蔬菜、釀造酒或作為飼料。甘肅省87個縣（市、區）中有60個縣種植馬鈴薯，甘肅定西有著“馬鈴薯之鄉”之稱，馬鈴薯是當地農民的主要經濟來源，也是該地區發展經濟的支柱產業之一。但是，近年來馬鈴薯在生產及儲藏過程中炭疽病發生日趨嚴重，已成為甘肅省馬鈴薯生產及儲藏中的主要病害之一，嚴重影響其儲藏時間和品質［1］。馬鈴薯炭疽病的研究可以追溯到20世紀初，目前該病廣泛分布于美國、日本和加拿大等50多個國家和地區［2］。該菌可以侵染馬鈴薯的各個生長部位［3］，侵染根部引起根腐爛，侵染維管束造成萎蔫，嚴重時引起植株枯萎［1］。據Tsror等［4］報道，該病害可使產量減少22%～30%，且塊莖品質也大受影響。據調查，馬鈴薯炭疽病在甘肅省武都、天祝和定西等地發生較重，楊成德等［1］對該病害的癥狀、病原及室內毒力測定結果進行了報道，但有關病原菌生物學特性及營養利用能力等方面的研究未見報道。因此，作者對該病原菌的生物學特性和營養利用（碳源、氮源）能力等進行了研究，以期為掌握該病害的發生規律和制定綜合防治措施提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌種：甘肅農業大學病理實驗室保存的馬鈴薯炭 疽 病 菌 ［Colletotrichum coccodes （Wallr.）Hughes］。

培養基：選用馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA培養基）、馬鈴薯蔗糖培養基（PSA培養基）、虎紅瓊脂培養基、燕麥片培養基、玉米粉培養基、査理固體培養基、查彼固體培養基、麥芽糖培養基、麥芽瓊脂培養基和水瓊脂培養基，參考文獻［5］進行配制。

1.2 方法

1.2.1 生物學特性研究

1.2.1.1 溫度對菌絲生長的影響

采用生長速率法。將病原菌接種于PDA平板中央，分別置于溫度為5、10、15、20、25、30、35和40℃的培養箱中培養，3次重復，3d后每隔1d用十字交叉法測定菌落直徑并描述菌落形態特征，直至生長最快溫度下滿皿。

1.2.1.2 溫度、濕度和pH對分生孢子萌發的影響

具體方法參考文獻［6］進行，即在干燥器內用硫酸法控制濕度，將孢子粉撒于載玻片上，設置相對濕度99%、95%、90%、85%和液態水5個處理，室溫下培養24h后挑取各處理的孢子，無菌水制片，立即檢查孢子萌發率，3次重復，鏡檢不少于10個視野，100個孢子，并計算孢子萌發率。

1.2.1.3 浸提液對孢子萌發的影響

配制各種浸提液（土壤浸提液，馬鈴薯幼苗期根、莖、葉浸提液，薯塊浸提液，其中水∶浸提液＝1∶10）懸滴法測定孢子萌發率，其他同1.2.1.2。

1.2.1.4 光照對孢子萌發的影響

用無菌水配制孢子懸浮液，懸滴法制片，置于全光照和全黑暗條件下處理，其他同1.2.1.2。

1.2.2 培養性狀研究

1.2.2.1 碳源和氮源對菌絲生長的影響

采用生長速率法，即將PDA平板上活化后的病原菌用直徑0.4cm的打孔器取菌餅，取1塊置于加1.5%不同碳源或加0.25%不同氮源的馬鈴薯瓊脂培養基中央，最適溫度下培養，3d后每隔1d用十字交叉法測定菌落直徑并描述菌落特征，直至生長最快碳源或氮源滿皿。具體碳源和氮源種類分別見圖7和圖9，以不加任何碳源或氮源的培養基為對照，具體方法參考文獻［7］進行。

1.2.2.2 培養基對菌絲生長的影響

采用生長速率法。將經PDA平板活化的病原菌用0.4cm直徑的打孔器切取菌餅，取1塊置于10種培養基（具體培養基種類見圖9）中央，其他同1.2.2.1。

2 結果與分析

2.1 生物學特性研究

2.1.1 溫度對菌絲生長的影響

馬鈴薯炭疽病菌在5～40℃范圍內均可生長，小于15℃和高于35℃時菌絲生長緩慢，25～35℃為較適宜溫度范圍，其菌落直徑顯著高于其他生長溫度（P＜0.05），30℃為最適生長溫度（圖1），此時在PDA培養基上培養7d菌落直徑為7.58cm，且有大量分生孢子盤形成，菌落質地均勻，表面有不明顯輪紋，無色素產生，無特殊氣味，菌落邊緣整齊且著生絮狀菌絲，偶有扇形突變。

圖1 溫度對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of temperature on colony growth of C.coccodes

2.1.2 溫度對分生孢子萌發的影響

分生孢子在5～40℃內均可萌發，20～30℃萌發率較高，25℃為最適萌發溫度，萌發率顯著高于其他溫度（P＜0.05），在溫度低于5℃和高于40℃時分生孢子不萌發，在5～25℃條件下，隨溫度升高，孢子萌發率隨之增大，當溫度高于25℃時，孢子萌發率隨溫度升高而呈現顯著下降趨勢（圖2）。

圖2 溫度對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發的影響Fig.2 Effects of temperature on conidial germination of C.coccodes

2.1.3 濕度對分生孢子萌發的影響

分生孢子在液態水中萌發率最高，達93.33%，顯著高于其他濕度條件（P＜0.05），在相對濕度99%時萌發率為18.95%，相對濕度為85%時萌發率僅為8.00%，即隨著相對濕度的下降孢子萌發率也顯著下降，該結果說明高濕度是該分生孢子萌發的必要條件，且液態水為該分生孢子萌發的最適濕度條件（圖3）。

圖3 濕度對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發的影響Fig.3 Effects of relative humidity on conidial germination of C.coccodes

2.1.4 pH對分生孢子萌發的影響

分生孢子在供試的pH范圍內均可萌發，但在pH6.47～7.38范圍內較高，且在pH6.7時其萌發率顯著高于其他pH條件（P＜0.05），說明pH對該分生孢子萌發影響明顯，但中性較適合該孢子萌發（圖4）。

圖4 pH對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發的影響Fig.4 Effects of pH value on conidial germination of C.coccodes

2.1.5 浸提液對分生孢子萌發的影響

分生孢子在薯塊浸提液中萌發率顯著高于葉、莖、根或土壤浸提液（P＜0.05），根浸提液萌發率顯著低于其他浸提液（P＜0.05）（圖5）。該結果說明薯塊中的化學物質對孢子萌發有促進作用，分生孢子在薯塊上容易萌發，而根較其他器官則不利于分生孢子的萌發。

圖5 營養液對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發的影響Fig.5 Effects of the extracts on conidial germination of C.coccodes

2.1.6 光照對孢子萌發的影響

在全光照條件下分生孢子萌發率略高于全黑暗條件，但差異不顯著（圖6），表明該分生孢子萌發對光不敏感，在有無光照條件下均能萌發。

圖6 光照對馬鈴薯炭疽病菌孢子萌發的影響Fig.6 Effects of light on conidial germination of C.coccodes

2.2 培養性狀研究

2.2.1 碳源對菌絲生長的影響

馬鈴薯炭疽菌對各種碳源均有較好的利用能力，菌絲生長良好，除D－阿拉伯糖和氯醛糖外菌落直徑均顯著高于對照（P＜0.05），對菌絲生長有明顯促進作用，但以氯醛糖為碳源時菌落直徑顯著小于對照（P＜0.05），對菌絲生長有抑制作用。該結果說明此菌對碳源要求不嚴格，能利用多種碳源，但利用能力有差異，利用能力高低依次為蔗糖＞葡萄糖＞甘露糖＞D－木糖＞麥芽糖＞D－半乳糖＞乳糖＞D－果糖＞可溶性淀粉＞D－阿拉伯糖＞氯醛糖。

圖7 碳源對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.7 Effects of carbon sources on colony growth of C.coccodes

2.2.2 不同碳源培養基上菌落特征

馬鈴薯炭疽病菌在葡萄糖培養基上菌落黑褐色，輪紋明顯，表面平鋪，質密，邊緣整齊，菌絲絮狀，無特殊氣味和色素產生（圖8a）；在D－阿拉伯糖和D－半乳糖培養基上菌絲茂密，產生淡褐色非水溶性色素，邊緣不整齊，呈折扇狀（圖8b）。在乳糖培養基上菌體質密，菌絲發達，分生孢子盤及產孢量大，菌落表面光滑；在D－果糖培養基上菌落輪紋明顯，顏色較深，分生孢子盤呈放射狀排列，無色素，無特殊氣味產生（圖8c）；在其余碳源培養基上菌落形態與葡萄糖培養基上基本相似。在對照培養基上分生孢子盤小且密生，菌落顏色淺，菌絲絮狀發達，表面光滑。

2.2.3 氮源對菌絲生長的影響

硝酸銨對炭疽菌生長有顯著促進作用（P＜0.05），在以氯化銨為氮源的培養基上炭疽菌生長較對照快，但差異不顯著（P＞0.05），其他供試氮源均不利于該菌生長，且在碳酸銨、L－谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L－組氨酸、L－精氨酸、亮氨酸、蛋白胨和甘氨酸為氮源的培養基上差異顯著（P＜0.05）（圖9）。該結果說明馬鈴薯炭疽病菌可以利用多種氮源，但對不同氮源的利用能力有差異。

圖8 碳源培養基上馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.8 The colony characteristics of C.coccodes on C－source media

2.2.4 氮源培養基上的菌落特征

在對照培養基上菌落輪紋明顯，菌絲生長旺盛，菌落顏色深，表面光滑，邊緣整齊，無色素產生，分生孢子盤小且密，產孢量大；在硝酸鈉、L－組氨酸、L－精氨酸、亮氨酸和L－谷氨酸培養基上輪紋不明顯，菌絲生長旺盛，菌落表面光滑，產孢量較大（圖10a）；在氯化銨、硝酸銨、碳酸銨和尿素培養基上菌絲發達呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產生，有特殊氣味，分生孢子盤大，產孢量大，但在尿素培養基上菌落輪紋明顯，而其他氮源培養基上輪紋不明顯；在大豆蛋白胨培養基上菌落顏色深，菌絲發達呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產生，有特殊氣味，產孢量大（圖10b）；在蛋白胨培養基上菌落輪紋明顯呈深淺相間的同心圓，菌絲發達呈絮狀，分生孢子盤小而密，無色素產生，有特殊氣味，產孢量大；在甘氨酸培養基上菌落輪紋明顯呈兩個同心圓狀，邊緣菌絲顏色淡，中央顏色深，分生孢子盤小而密，無色素產生，有特殊氣味，產孢量大（圖10c）。

圖9 氮源對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.9 Effects of N－source on colony growth of C.coccodes

圖10 氮源培養基上馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.10 The colony characteristics of C.coccodes on N－source media

2.2.5 不同培養基對菌絲生長的影響

馬鈴薯炭疽菌在PDA和麥芽汁培養基上菌落直徑顯著高于其他培養基（P＜0.05），而在玉米粉及水瓊脂上顯著小于其他培養基（P＜0.05）。該菌在馬丁氏培養基上菌落邊緣整齊，表面光滑，菌絲發達，菌落中央顏色略深，邊緣較淡，分生孢子盤少；玉米粉培養基上菌落輪紋明顯，表面粗糙，有淡褐色水溶性色素產生；麥芽糖和麥芽汁培養基上菌落輪紋明顯，無特殊氣味，有淡褐色水溶性色素產生，菌絲發達，有較多分生孢子盤形成（圖12a）；燕麥片和查彼培養基上菌落輪紋不明顯，表面光滑，無色素產生，有無色氣生菌絲產生，菌落近透明，有較多分生孢子盤形成（圖12b）；查理培養基上菌落輪紋不明顯，表面粗糙，有橘紅色非水溶性色素產生，無分生孢子盤產生（圖12c）；PDA和PSA培養基上菌絲顏色淡，無同心輪紋，無色素產生，有無色氣生菌絲產生，菌落近透明，有較多分生孢子盤形成；水瓊脂培養基上菌落輪紋不明顯，表面光滑，邊緣整齊，無色素產生，氣生菌絲少，菌落近透明，分生孢子盤少。

圖11 培養基對馬鈴薯炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.11 Effects of medium on colony growth of C.coccodes

圖12 不同培養基上的馬鈴薯炭疽病菌菌落特征Fig.12 The colony characteristics of C.coccodes on different media

3 討論與結論

已研究報道的馬鈴薯病害有幾十種［8］，但報道較多的是馬鈴薯晚疫病、病毒病（PVX和PVY）、軟腐病、環腐病和黑脛病等在生產中較常見的病害，對這些病害的病原學、發生規律及防治技術等均有較系統的 研 究［9－11］。 許 多 研 究 者［12－13］認 為，生 長 期 病原菌危害薯塊，造成薯塊帶菌或潛伏侵染后，在貯藏期條件適宜時引起薯塊腐爛，如馬鈴薯塊莖干腐病、馬鈴薯晚疫病和馬鈴薯環腐病等薯塊帶菌均可引起貯藏期薯塊腐爛。馬鈴薯炭疽病也為生長期和貯藏期均發生的重要病害之一，但國內文獻較少。因此，本試驗研究了該病原菌的生物學特性，結果表明，該病原菌菌絲在20～30℃生長較快，30℃為最適生長溫度，與文獻［14］報道一致；該菌分生孢子最適萌發溫度為25℃，5℃時分生孢子不萌發，與文獻報道［14］一致；分生孢子在液態水中萌發率最高，達93.33%，隨著相對濕度下降萌發率也下降，說明高濕有利于分生孢子萌發；分生孢子在pH6.7時萌發率最高，與文獻報道一致［14］；分生孢子萌發對光不敏感，在有、無光照條件下都能萌發。在薯塊浸提液中萌發率最高，而在根、莖、葉浸提液中萌發率很低，此可能由于本試驗所選用的是馬鈴薯幼苗期根、莖和葉，是否幼苗期根、莖和葉比成熟期抗病還需進一步研究。該病原菌可以廣泛利用碳、氮源，并且在不同培養基上菌落形態、產孢能力及生長速率不同，說明該菌對不同營養的利用能力有差異，這些差異能否用來對該菌進行分類或在病害綜合防治中應用還須進一步研究。本試驗較詳細地報道了馬鈴薯炭疽病菌的生物學特性及對不同碳、氮源的利用能力等，可為了解該病害的發生規律及制定綜合控制措施提供依據。

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