柑橘皮乙醇提取物中抑菌成分的分離與鑒定

朱 蔚， 高旭暉， 秦金花， 張 梁

（農業部茶葉生物化學與生物技術重點實驗室，合肥 230036）

柑橘是我國最重要的果品資源之一，柑橘在加工生產橘汁或生鮮食用時，約產生40%～50%的皮渣，這些皮渣中含有許多有用的成分［1］。目前國內外研究表明，柑橘含有豐富的黃酮類化合物，其具有抗氧化、抗癌作用，預防心血管疾病、抗炎、抗過敏作用，抗病毒、抑菌作用，還可以預防動脈粥樣硬化和膽固醇的增加［2－4］。近些年來，對其在防治農業病原菌方面的作用日益得到重視。研究發現：柑橘皮粗提物中的黃酮類和檸檬苦素類物質均具有抑菌效果［5－7］。嚴贊開［8］等研究了橘皮中橙皮苷對食品常見污染菌有廣譜的抑菌作用。趙寶玉［9］等研究發現：橘皮乙醚、丙酮、乙醇3種溶劑提取物對5種霉菌均有不同程度的抑制作用。李凌緒［10］等證實了橘皮石油醚、乙酸乙酯、乙醇的提取物對7種農業植物病原真菌具有明顯的抑菌活性。孫崇德［11］研究證明柑橘中提取的檸檬苦素和諾米林對青霉和黑曲霉兩種真菌的抑菌效果明顯，而對細菌生長的抑制作用非常微弱。目前，國內外對柑橘皮的抑菌活性研究較多，但其對茶樹病原菌的研究少見報道。鑒于此，本文對柑橘皮乙醇提取物中的抑菌物質進行了分離鑒定，并就這些物質對茶云紋葉枯病病原菌的抑制作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試原料

為市售新鮮柑橘（產地為江西婺源），剝皮后自然晾干，粉碎備用。

1.1.2 供試病原菌

茶云紋葉枯病（Colletotrichum camelliae Massee）病葉從安徽農業大學茶業系實驗茶園內采集，分離，經顯微觀察鑒定為茶云紋葉枯病病原菌的分生孢子，經單孢分離獲得純培養。

1.1.3 供試試劑

硅膠：柱層析（100～200目，200～300目），硅膠薄層板（GF254）均為青島海洋化工廠出品；凝膠：Sephadex LH－20為Pharmacia公司出品；溶劑：石油醚、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、甲酸、正丁醇、二甲基亞砜（DMSO）、氘代氯仿為國產分析純；顯色劑：98%濃硫酸－乙醇溶液（V／V＝5∶95）；農藥：75%百菌清可濕性粉劑；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 抑菌活性物質分離

稱取一定量晾干的柑橘皮，粉碎后用95%乙醇加熱至50℃超聲提取3次，每次3h，將3次提取液混合，離心取上清液，減壓濃縮回收溶劑后得31.95g浸膏。稱取乙醇提取物浸膏10g，溶于100mL水，即乙醇提取物濃度為100mg／mL，依次用石油醚（60～90℃）、二氯甲烷、正丁醇萃取，減壓濃縮后得石油醚部位浸膏8mg，二氯甲烷部位浸膏11.2mg，正丁醇部位浸膏200mg，水部位浸膏110.4mg。

1.2.2 乙醇提取物柱層析分離

另稱取乙醇提取物5g用少量混合溶劑溶解，加入100～200目硅膠均勻拌樣，揮干溶劑后，用硅膠（100～200目）濕法裝柱進行層析分離，以氯仿－甲醇作為洗脫劑進行梯度洗脫（2∶0～0∶2，V／V），等樣法接樣每次接50mL。經薄層層析指導合并，減壓濃縮得到5個不同極性段組分：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4Fr.5 用氯仿－甲醇（1∶1 對Fr.31.5g 進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜，得到流分JP－EtoH－1（橘皮的乙醇部分1）及Fr.3′，用氯仿－甲醇（1∶1）對Fr.4進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜，得到流分JP－EtoH－2及Fr.4′，用氯仿－甲醇（1∶1）對JP－EtoH－2（400mg）進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜分離，得到化合物Ⅰ；用氯仿－甲醇（1∶1）對JP－EtoH－1進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜，再用氯仿－甲醇（15∶1）進行反復硅膠柱色譜，得到化合物Ⅱ；將流分Fr.3′和Fr.4′混合，用石油醚－乙酸乙酯（4∶5）、純氯仿進行硅膠柱色譜，得到流分JP－EtoH－6、JP－EtoH－7、JP－EtoH－8、JP－EtoH－9。用氯仿－甲醇（1∶1）對JPEtoH－8進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜，得到化合物Ⅲ；用氯仿－甲醇（1∶1）對JP－EtoH－6進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜，再用氯仿－乙酸乙酯（25∶1）進行硅膠柱色譜，再用氯仿－甲醇（1∶1）進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜純化，得到化合物Ⅳ。用氯仿－甲醇（100∶1）對Fr.1進行硅膠柱色譜，再進行Sephadex LH－20凝膠柱色譜，分離得到化合物Ⅴ。

1.2.3 4種萃取物抑菌活性測定

采用生長速率法［12～13］對柑橘皮萃取物進行抑菌活性測定。將4個部位萃取物分別全部溶解于10mL丙酮，即石油醚部位最高濃度為0.8mg／mL、二氯甲烷部位最高濃度為1.12mg／mL、正丁醇部位最高濃度為20mg／mL、水部位最高濃度為11.04mg／mL，然后采用倍半稀釋法分別將4個萃取部位用丙酮稀釋配制成由高濃度到低濃度的濃度梯度共5個梯度。取1mL配制好的萃取物，與培養基混勻制成含藥的平板。4種溶劑萃取物各為1處理，丙酮為對照，共設5個處理，每處理重復3次。用直徑為6mm的打孔器打成大小均一的菌餅，將菌餅菌絲面向下接種于含藥平板中央。接好菌種后置于28℃條件下培養，測量菌落直徑（十字交叉法量2次，取其平均數）并用下列公式計算菌絲生長抑菌率。

1.2.4 5種化合物抑菌活性測定

孢子懸浮液制備：取培養10d的菌種，逐漸加入適量的無菌水，振蕩，即獲得孢子懸浮液，借助血球計數板鏡檢，配成濃度為1.3×106cfu／mL的菌懸液。

采用抑菌圈法 對化合物進行抑菌活性測定。采用倍半稀釋法將樣品用DMSO稀釋配制成由高濃度到低濃度的濃度梯度（1000、500、250、125、62.5μg／mL）共5個梯度。用DMSO溶液作為陰性對照，75%百菌清可濕性粉劑為陽性對照。用微量移液器吸取60μL菌液于平板，用無菌“L”型玻棒在平板上均勻密集劃線，待菌液干燥后，用外徑6mm的打孔器打孔，每孔加藥液20μL，平放在28℃真菌培養箱培養觀察結果，測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑取兩次試驗結果的平均值。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定

化 合 物Ⅰ 黃 色 粉 末，1H－NMR（500MHz，CDCL3）δ：7.86（2H，d，j＝8.5Hz，H－2′，6′），7.01（2H，d，j＝9Hz，H－3′，5′），6.59（1H，s，H－3），4.09（3H，s，OCH3），4.01（3H，s，OCH3），3.94（6H，s，2×OCH3），3.87（3H，s，OCH3），該化合物與文獻［15］5，6，7，8，4′－五甲氧基黃酮一致，鑒定化合物Ⅰ為5，6，7，8，4′－五甲氧基黃酮。

化合物Ⅱ 淺黃色結晶，1H－NMR（500MHz，CDCL3）δ：12.54（1H，s，OH－5），7.58（1H，d，J＝7Hz，H－6′），7.43（1H，s，H－2′），7.00（1H，d，J＝8.5Hz，H－5′），6.62（1H，s，H－3），4.11（3H，s，OCH3），3.98（6H，d，2×OCH3），3.96（3H，s，OCH3），3.90（3H，s，OCH3），該化合物與文獻［15］5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮一致，鑒定化合物Ⅱ為5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮。

化合 物 Ⅲ 黃 色 粉 末，1H－NMR（500MHz，CDCl3）δ：7.57（1H，d，J＝8Hz，H－6′），7.42（1H，s，H－2′），6.99（1H，d，J＝8.5Hz，H－5′），6.64（1H，s，H－3），4.11（3H，s，OCH3），4.03（3H，s，OCH3），3.98（3H，s，OCH3），3.97（3H，s，OCH3），3.96（6H，s，2×OCH3），該化合物與文獻［16］5，6，7，8，3′，4′－六甲氧基黃酮一致，鑒定化合物Ⅲ為川陳皮素。

化 合 物 Ⅳ 淺 黃 色 粉 末，1H－NMR（500Mz，CDCl3）δ：7.50（1H，d，J＝x8.5Hz，H－6′），7.33（1H，d，j＝1.5Hz，H－2′），6.98（1H，d，J＝8.5 Hz，H－5′），6.80（1H，s，H－3），6.60（1H，s，H－8），4.00（9H，t，3×OCH3），3.97（3H，s，OCH3），3.94（3H，s，OCH3）該化合物與文獻［15］5673′4′－五甲氧基黃酮一致，鑒定該化合物Ⅳ為5，6，7，3′，4′－五甲氧基黃酮。

化合物Ⅴ 白色針狀結晶，1H－NMR（500MHz，C5H5N）δ：4.29（1H，d，J＝3.5Hz，H－1），3.05（1H，d，J＝16.5Hz，Ha－2），3.19（1H，dd，J＝3.5，16.5Hz，Hb－2），2.62（1H，dd，J＝3.5，15.0Hz，H－5），2.54（1H，dd，J＝3.5，15.0Hz，Ha－6），3.24（1H，t，J＝15.0Hz，Hb－6），2.78（1H，dd，J＝2.5，12.0Hz，H－9），1.83（1H，m，Ha－11），1.97（1H，m，Hb－11），1.33（1H，m，Ha－12），1.84（1H，m，Hb－12），4.63（1H，s，H－15），5.73（1H，s，H－17），1.26（3H，s，CH3－18），4.69（1H，d，J＝13.5Hz，Ha－19），5.21（1H，d，J＝13.5Hz，Hb－19），7.71（1H，t，J＝1.0Hz，H－21），6.52（1H，dd，J＝1.0，1.5 Hz，H－22），7.63（1H，dd，J＝1.0，1.5Hz，H－23），1.18（3H，s，CH3－28），1.24（3H，s，CH3－29），1.26（3H，s，CH3－30），該化合物與文獻［17］檸檬苦素一致，鑒定化合物Ⅴ為檸檬苦素。

2.2 4種溶劑萃取物的抑菌活性

由表1可知，當石油醚部位濃度為0.8mg／mL，其對茶云紋葉枯病病原菌的抑制率達80.9%；當二氯甲烷部位濃度為1.12mg／mL時，其對茶云紋葉枯病病原菌的抑制率為60.6%；而正丁醇部位和水部位對病原菌的抑菌活性較低。由此可見，柑橘皮乙醇提取物抑菌活性成分主要集中在石油醚部位和二氯甲烷部位。

表1 4種萃取物對茶云紋葉枯病病原菌的抑菌活性Table 1 Fungicidal activity of four kinds of extracts against mycelium growth of C.camelliae

2.3 石油醚和二氯甲烷萃取部分對病原菌的毒力

由表2可知，柑橘皮乙醇提取物的石油醚部位對茶云紋葉枯病病菌的抑制效果最好，EC50為0.1638mg／mL；其次為二氯甲烷部位，EC50為0.7643mg／mL。

表2 石油醚和二氯甲烷萃取部位對茶云紋葉枯病病原菌的毒力Table 2 Antifungal virulence of petroleum ether partition and methylene dichloride partition against mycelium growth of C.camelliae

2.4 柑橘皮乙醇提取物5種化合物對茶樹云紋葉枯病病原菌的抑菌效果

由表3可知，當供試濃度為1000μg／mL時，柑橘皮乙醇提取物5個化合物中5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮和檸檬苦素對茶云紋葉枯病原菌有很好的抑制作用，抑菌直徑分別達13.47和16.05mm，見表3。

表3 柑橘皮5種化合物對茶樹云紋葉枯病原菌的抑菌直徑Table 3 The diameters of inhibition zones of five compounds against C.camelliae

3 討論

研究結果表明，柑橘皮乙醇提取物中石油醚部位和二氯甲烷部位對茶云紋葉枯病病原菌有較好的抑制效果，抑制率分別達80.9%和60.6%；生長速率法測定石油醚部位對茶云紋葉枯病病原菌的EC50為0.1638mg／mL。這說明，柑橘皮的抑菌成分主要集中在小極性部位。本研究對柑橘皮乙醇提取部位進行了分離，發現了5個主要化合物，其中檸檬苦素和5－羥基－6，7，8，3′，4′－五甲氧基黃酮對茶云紋葉枯病原菌的抑制作用較強，這些初步結果可為植物源農藥的開發和利用提供依據。

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