梨成熟果實對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力的評價

趙 梅， 陶書田， 齊開杰， 陳盛君， 張紹鈴

（南京農業大學梨工程技術研究中心，南京 210095）

梨 炭 疽 病 （pear anthracnose）和輪紋 病 （pear ring rot）是梨樹兩大主要病害。梨炭疽病菌為半知菌亞門刺盤孢屬的膠孢炭疽菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］［1］，主要危害果實，使果實腐爛、早落、影響產量和品質。梨輪紋病菌為子囊菌亞門葡萄座腔菌屬的梨生孢囊殼菌（Botryosphaeria berengeriana de Not.）［2］，主要危害枝干和果實，葉片受害比較少見。梨輪紋病除危害梨，還可危害蘋果、山楂、桃等果樹。培育和利用抗病品種是防治病害的最有效、最符合農業可持續發展要求的措施，因此鑒定梨品種對炭疽病菌和輪紋病菌的抗性是抗病育種的關鍵環節之一。目前，不同梨品種果實對炭疽病菌抗性的評價還未見報道，而對輪紋病菌抗性的評價雖有部分報道［3－5］，但所試驗品種有限。病原菌在寄主體內擴展是導致其發病的重要階段之一，因此研究寄主抗病原菌擴展能力對于評價其抗病性具有較好的指導意義。本研究對101份梨種質資源的成熟果實進行室內接種梨炭疽病菌和輪紋病菌，測定各梨品種果實對兩種病菌的抗擴展能力。本研究首次利用聚類分析方法對梨成熟果實抗炭疽病菌和輪紋病菌擴展能力分類，該分類方法比較靈活，可以根據研究目的及研究對象而調整，使分類在定量和定性方面得到統一。同時，對梨果實抗病菌擴展能力及果實主要生理指標進行相關性分析。本研究不僅為梨優質生產技術提供理論支撐，還可為梨種質資源評價、篩選及抗性育種提供重要理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年7月－10月，以南京農業大學江浦梨資源圃的101個梨品種果實為試材。梨炭疽病菌和輪紋病菌由南京農業大學植物保護學院劉鳳權課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

于各品種的成熟期采摘梨果實，不同梨品種成熟期的確定參考各品種往年成熟期和種子顏色變成褐色且果實組織沒有衰老。每個品種選取長勢中等、產量一致的5株樹，在每株樹冠外圍不同方向隨機選取5個大小一致、無病蟲害果實，每個品種共計25個果實。10個果實用于接種炭疽病菌，10個果實用于接種輪紋病菌，5個果實用于測定該品種主要生理指標。

1.2.2 接種方法

取生長均一的梨炭疽病菌及輪紋病菌菌絲培養物，連同培養基用直徑5mm打孔器采下菌餅。用酒精棉（75%乙醇浸泡）對梨表面進行消毒處理，在每個梨果實中偏上部針刺接種菌餅，每果接種2個菌餅，封口膜密封固定。接種后的果實置于28℃恒溫培養箱內培養，培養6d，測量病斑直徑。病斑直徑越大，表明梨品種對病菌抗擴展能力越小。

1.2.3 果實主要生理指標測定

總酚含量的測定采用福林酚法［6］，以沒食子酸為基準物質，計算梨果肉多酚含量。石細胞含量測定參照聶繼云等［7］的冷凍分離法進行。木質素含量測定參照Sancho等［8］的方法。

1.3 數據處理

試驗數據用SPSS13.0軟件統計分析。依據病斑直徑，運用歐氏最長距離法，對101個梨品種進行聚類分析。同時，對梨果實炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑與梨果肉總酚、石細胞以及木質素含量作相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同梨品種果實對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力及其生理指標變化特點

101個梨品種果實炭疽病病斑直徑和輪紋病病斑直徑及其生理指標見表1。從表1可以看出：不同梨品種感病（炭疽病和輪紋病）后的病斑直徑差異較大。其中，炭疽病病斑直徑為0.6～4.0cm，均值為2.4cm；輪紋病病斑直徑為1.8～6.7cm，均值為3.9cm。由此可知，總體上，輪紋病病斑直徑平均比炭疽病病斑直徑大，即梨種質資源對輪紋病菌的抗擴展能力低于對炭疽病菌的抗擴展能力。在所有供試梨品種果實中，‘巴梨’總酚含量最高，為0.859A／g，‘秋榮’總酚含量最低，為0.163A／g，101個梨品種果實總酚含量均值是0.323A／g；石細胞含量差異很大，含量變化范圍在0.010～1.036g／100g，均值為0.233g／100g，大部分品種集中在0.1～0.65g／100g，占所有品種的77.8%，只有2個品種大于0.65g／100g，分別為‘白皮酥’和‘金川野生梨2號’；木質素含量變化范圍為0.140～0.547A／10g，均值為0.303A／10g。

表1 炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑及其主要生理指標Table 1 The main physiological factors of fruits and lesion diameters of fruit anthracnose and ring rot

續表1 Table1（Continued）

續表1 Table1（Continued）

2.2 不同梨品種果實對炭疽病菌和輪紋病菌的抗擴展能力的聚類分析

根據101個梨品種果實炭疽病病斑直徑的差異，進行不同梨品種果實對炭疽病菌抗擴展能力分類。以最長距離法λ＝7.0，可以將101個品種劃分為5類，其結果繪成譜系（圖1）。

圖1 101個梨品種果實對炭疽病菌抗擴展能力聚類分析圖Fig.1 Cluster analysis of anti－expansion capacity against the pathogens of anthracnose in fruits of 101 Pyrus species

其中第一類抗擴展性強，病斑直徑為0.638～1.537cm，有14個品種，占測定品種的13.9%；第二類抗擴展性較強，病斑直徑為1.645～2.153cm，有23個品種，占測定品種的22.8%；第三類抗擴展性中等，病斑直徑為2.197～2.879cm，有41個品種，占測定品種的40.6%；第四類抗擴展性較弱，病斑直徑為2.962～3.448cm，有17個品種，占測定品種的16.8%；第五類是抗擴展性弱，病斑直徑為3.544～3.974cm，只有6個品種，占測定品種的5.9%。

以上述梨果實對炭疽病菌抗擴展能力的評價方法，進行梨果實對輪紋病菌抗擴展能力的聚類分析，101個品種也劃分為5類，其結果繪成譜系（圖2）。其中第一類抗擴展性強，病斑直徑為1.856～2.755cm，有22個品種，占測定品種的21.8%；第二類抗擴展性較強，病斑直徑為2.896～3.481cm，有17個品種，占測定品種的16.8%；第三類抗擴展性中等，病斑直徑為3.578～4.550cm，有36個品種，占測定品種的35.6%；第四類抗擴展性較弱，病斑直徑為4.689～5.996cm，有24個品種，占測定品種的23.8%；第五類抗擴展性弱，病斑直徑為6.714～6.720cm，僅有2個品種，占測定品種的2.0%。

圖2 101個梨品種果實對輪紋病菌抗擴展能力聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of anti－expansion capacity against the pathogens of ring rot in fruits of 101 Pyrus species

聚類分析結果表明，對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力均為中等的梨品種最多，而對上述兩種病菌表現為抗擴展性弱的品種最少。

2.3 梨果實對炭疽病菌和輪紋病菌的抗擴展能力與其主要生理指標相關性分析

對梨果實炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑與梨果肉總酚、石細胞以及木質素含量作相關性分析（表2），結果表明，炭疽病病斑直徑和輪紋病病斑直徑呈極顯著正相關（R＝0.687＊＊），可見不同品種梨果對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力呈極顯著正相關；果肉總酚含量與炭疽病病斑直徑呈極顯著負相關，與輪紋病菌病斑直徑呈顯著負相關，說明梨果肉總酚含量與果實對炭疽病菌抗擴展能力呈極顯著正相關，與果實對輪紋病菌抗擴展能力呈顯著正相關；果肉石細胞含量和上述兩種病害的病斑直徑均呈負相關，其中與輪紋病病斑直徑達到極顯著水平，表明果肉石細胞含量和梨果實對炭疽病菌抗擴展能力呈正相關，和梨果實對輪紋病菌抗擴展能力呈極顯著正相關；而果肉木質素含量和這兩種病害的病斑直徑相關性不明顯，說明果肉木質素含量和梨果實對這兩種病菌的抗擴展能力相關性均不明顯。

表2 炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑與其生理指標相關性分析Table 2 Relative analysis of the lesion diameters of fruit anthracnose and ring rot and main physiological factors in pear fruits

3 討論

梨炭疽病和輪紋病是梨樹兩大主要病害，是成熟期和貯藏期導致果實腐爛的重要原因［2－3］。為生產優質梨果，選擇栽培抗病品種是最經濟、有效的措施。不同寄主對病原菌的抗擴展能力對研究不同寄主對病原菌的抗性具有重要的指導意義。本研究對101個梨品種分別進行室內接種炭疽病和輪紋病，并通過聚類分析及相關分析等方法進行供試品種對兩種病菌的抗擴展能力的評價和鑒定。結果表明，不同梨品種對兩種病菌的抗擴展能力差異較大，總體上所測試的梨品種對輪紋病菌抗擴展能力低于對炭疽病菌的抗擴展能力。

本研究采用室內人工接種果實的方法進行梨品種果實對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力的評價，可以減少外界不確定性因素干擾以及進行果實套袋或菌體保濕等工作的人力和資源耗費［9］。但其結果是否與田間自然抗性鑒定結果具有很好的正相關，以及是否以室內人工接種鑒定更為準確，還有待進一步研究。

本研究首次采用聚類分析方法進行不同梨品種對病菌抗擴展能力的研究。聚類分析的功能是建立一種分類方法，它將一批樣品或變量按照它們在性質上親疏程度進行分類［10］。將供試品種劃為若干類群，類群內具有相似的抗性反應組合，而類群間具有較明顯的抗性反應差異。在本研究中，根據最長距離法（λ＝7.0），101個梨品種對炭疽病菌和輪紋病菌的抗擴展能力均可分為5類，即抗擴展性強、較強、中等、較弱、弱。不同梨品種果實對炭疽病菌抗擴展能力聚類分析結果表明，抗擴展性強的品種14個、抗擴展性較強的品種23個、抗擴展性中等的品種41個、抗擴展性較弱的品種17個、抗擴展性弱的品種6個，分別占供試品種的13.9%、22.8%、40.6%、16.8%、5.9%。梨果實對輪紋病菌抗擴展能力分類結果表明，抗擴展性強的品種22個，抗擴展性較強的品種17個，抗擴展性中等的品種36個，抗擴展性較弱的品種24個，抗擴展性弱的品種2個，分別占測定品種的21.8%、16.8%、35.6%、23.8%、2.0%。結果分析表明，在101個供試梨品種中，對上述兩種病菌抗擴展能力均為中等的品種所占比率最多，而對上述兩種病菌表現為抗擴展性弱的品種所占比率最少。

酚類物質是植物體內重要的次生代謝物質，其與植物抗病性密切相關［11］。植物積累酚類物質的來源主要有兩個，一是寄主品種原始酚類物質的積累，二是在病原菌侵染后，宿主細胞迅速作出反應，酚類物質迅速積累［12］。劉海英等［13］對蘋果成熟期果實進行輪紋病菌的接種，研究結果表明蘋果果實總酚含量是果實輪紋病發病的負相關因子。本研究發現，梨果肉中總酚含量與梨果實對炭疽病菌抗擴展能力呈極顯著正相關，與梨果實對輪紋病菌抗擴展能力呈顯著正相關，研究結果與劉海英等［13］的結果較為一致。木質素是高等植物重要的結構物質，木質素的累積是抗病菌侵入的主要因素［11］。但本研究結果顯示，梨果肉木質素含量與梨果實對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力相關性不明顯，但是果肉中石細胞的含量與梨果實對炭疽病菌和輪紋病菌抗擴展能力呈正相關，其中與梨果實對輪紋病菌抗擴展能力相關性達到極顯著水平。木質素是石細胞的主要成分，Ranadive等［14］發現‘Yuzuhada’梨果實石細胞中含有18%的木質素，而Tao等［15］報道‘碭山酥梨’石細胞中木質素含量高達30%。在本研究中，石細胞與果實對病菌抗擴展能力呈現負相關，是否主要是由于木質素的作用，還有待于進一步研究。

［1］ 吳良慶，朱立武，衡偉，等.碭山梨炭疽病病原鑒定及其抑菌藥劑篩選［J］.中國農業科學，2010，43（18）：3750－3758.

［2］ 張磊，常有宏，劉郵洲，等.梨輪紋病和炭疽病病原菌PCR檢測［J］.江蘇農業學報，2012，28（2）：415－420.

［3］ 田路明，董星光，曹玉芬，等.梨品種資源果實輪紋病抗性的評價［J］.植物遺傳資源學報，2011，12（5）：796－800.

［4］ 李樹玲，林珂，黃禮森，等.梨果實抗輪紋病初步鑒定［J］.天津農學院學報，1996，3（4）：36－39.

［5］ 曹玉芬，孫秉鈞，李美娜，等.梨品種果實對輪紋病的抗性鑒定［J］.果樹科學，1999，16（3）：180－184.

［6］ Franciseo mlld,Resurreccion A.Total phenolics and antioxidant capacity of heat-treated peanut skins [J]Journal of Food Composition and Analysis,2009,22:16-24.

［7］ 聶繼云，李靜，楊振鋒，等.冷凍法測定梨的石細胞含量［J］.果樹學報，2006，23（1）：133－135.

［8］ Sancho M A，Forchetti S M，Pliego F，et al.Peroxidase activity and isoenzymes in the culture medium of NaCl adapted tomato suspension cells［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，1996，44：161－167.

［9］ 張麗麗，常有宏，藺經，等.不同梨品種果實對梨輪紋病菌的抗性［J］.江蘇農業學報，2010，26（2）：440－442.

［10］唐啟義，馮明光.實用統計分析及其DPS數據處理系統［M］.北京：科學出版社，2002：332－356.

［11］高必達，陳捷.生理植物病理學［M］.北京：科學出版社，2006：160－162.

［12］邱永祥，柯玉琴，代紅軍，等.甘薯抗蔓割病的酚類物質代謝的研究［J］.中國生態農業學報，2007，15（5）：167－170.

［13］劉海英，李川.影響蘋果果實輪紋病抗性的寄主因素及相關性分析［J］.河北農業大學學報，2003，26（1）：56－60.

［14］Ranadive A，Haard N.Chemical nature of stone cells from pear fruit［J］.Journal of Food Science，1973，38：331－333.

［15］Tao S，Khanizadeh S，Zhang H，et al.Anatomy，ultrastructure and lignin distribution of stone cells in two Pyrus species［J］.Plant Science，2009，176：413－419.