可視化核酸試紙條法快速檢測松材線蟲

張裕君， 王金成， 魏亞東

（天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461）

松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）屬重要的檢疫性有害生物，引起的松材線蟲病是世界上最具危險性的森林病害［1－2］。該病已在多個國家發生和流行，且呈擴散蔓延趨勢。我國自1982年首次在南京市發現松材線蟲病，目前已蔓延擴散到廣東、江蘇、浙江、安徽、山東等省，對我國林業造成了嚴重破壞，對松林的安全構成了嚴重威脅。檢疫是防止該病遠距離傳播最有效的方式，而簡單、快速、準確、靈敏的檢測技術是實施有效檢疫的強力手段，因此針對松材線蟲的檢測技術研究具有重要意義。

松材線蟲的檢測方法主要有形態學檢測、生化檢測和分子生物學檢測三大類［3］，形態學對經驗的要求比較高，而且存在幼蟲鑒定困難等等問題，生化檢測相對用得較少，松材線蟲的分子檢測技術主要有特異 性 引 物 PCR 法［4－5］、ITS－PCR－RFLP 法［6］和實時 熒 光 定 量 PCR 法［7－9］（quantitative real－time PCR，qPCR）。這些方法具有高效、快速、低污染等優點，但是特異性引物PCR法、ITS－PCR－RFLP法需要電泳、染色、成像等多個步驟，而實時熒光定量PCR法所使用的儀器設備投入大、標記探針、試劑成本高，限制了該方法的推廣［10］。

膠體金免疫層析法（gold immunochromagraphy assay）是20世紀80年代末發展起來的一種快速的免疫學測定方法［11］，它是膠體金標記技術和免疫層析技術相結合的產物，基本原理是利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，使抗原抗體發生反應，在檢測線位置，陽性反應在試紙條上出現紅色條帶，陰性反應不顯色。通過核酸引物兩端修飾相應標記物（如生物素、熒光素），同時試紙條上相應位置標記對應抗體，就可以實現核酸產物的試紙條檢測。核酸試紙條技術已經在結核分枝桿菌 甲型H1N1病毒［13－14］、外源 基 因 EPSPS 的 檢 測［15］等 方 面 都 有 了成功應用的報道，本研究在特異性引物PCR方法的基礎上，結合核酸試紙條檢測技術，建立一種簡單、快速、準確、靈敏的可視化松材線蟲分子檢測技術。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試劑

本試驗測試了近年來天津出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室截獲的來源于國外的8個線蟲種群和4個來自我國江蘇的線蟲種群，并經過了形態及測序驗證，其中包括4個擬松材線蟲種群，3個傘滑刃線蟲種群，1個真滑刃屬線蟲種群，4個松材線蟲種群。同時測定了2種植物材料和2種真菌材料（表1）。

表1 供試樣本的種類及來源Table 1 Isolates and origins of samples used in this study

主要試劑為 TIANamp Genomic DNA Kit（購自TIANGEN 公 司）；Ex Taq 酶 試 劑、DL2000DNA Marker（購自TaKaRa公司）；通用型核酸擴增物快速檢測試紙條（購自杭州優思達生物技術有限公司）。

試驗主要儀器為PCR儀（PTC－200DNA Engine）；電泳儀（Bio－RAD）；紫外凝膠成像系統（Infinity－3026）。

1.2 線蟲基因組DNA提取及PCR擴增

1.2.1 線蟲基因組DNA提取

將適量線蟲放入1.5mL離心管，稍離心，預冷后加入適量液氮，用研棒研磨至粉末狀，然后依次加入緩沖液GA、蛋白酶K、緩沖液GB，70℃水浴放置10min，加入乙醇振蕩，混合液加入吸附柱CB3后離心，漂洗2次，晾干吸附柱，在吸附膜滴加50μL TE，離心后得到線蟲基因在DNA，－20℃保存備用。

1.2.2 PCR引物設計

根據截獲的松材線蟲測序所得的ITS DNA序列，并通過NCBI比對分析，利用引物設計軟件Oligo 6.0設計一對針對松材線蟲的特異性引物及下游引物的競爭引物，片段大小為197bp，上、下游引物的5′端分別修飾有生物素（biotin）和熒光素（FITC），由Invitrogen公司合成。

上 游 引 物：Bx－F3－bio 5′－TCTGCACGTTGTGACAGTC－3′；下 游 引 物：Bx－B3－fit 5′－TCATCCGAACGTCCCTGAC－3′；競 爭 引 物：Bx－B3－comp 5′－GTCAGGGACGTTCGGAACT－3′；相 關 引 物 序列已申請發明專利（專利申請號：20120231555.8）。

1.3 松材線蟲基因組DNA引物特異性試驗

試驗以滅菌超純水作為空白對照，分別以Bm－Js1、BmJs2、BmSk1、BmSk2、BdSk1、BFSk1、BrSk1、Auk線蟲種群和2種植物、2種真菌樣本作為陰性對照，以BxUs1、BxUs2、BxJs1、BxJs2等松材線蟲作為陽性對照，應用松材線蟲特異引物對（Bx－F3－bio、Bx－B3－fit）進行PCR擴增。

PCR反應體系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq酶（5U／μL）0.25μL，ddH2O 19.25μL，總體積25μL，隨后進行PCR擴增。PCR反應條件：94℃ 預變性2min，1個循環；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；最后72℃延伸10min。取10μL PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統上觀察并記錄結果。

1.4 PCR產物試紙條檢測試驗

取5μL擴增產物滴加在試紙條的樣品墊上，同時滴加2～3滴緩沖液，10min后觀察質控線、檢測線，判讀出陰、陽性的結果。

1.5 PCR擴增中競爭引物最適比例的篩選

試驗將上、下游引物與競爭引物（Bx－F3－bio：Bx－B3－fit：Bx－B3－comp）的比例分別按 A（0.5∶0.5∶1）、B（0.5∶0.5∶2）、C（0.5∶0.5∶3）、D（0.5∶0.5∶4）、E（0.5∶0.5∶5）分為5組，每組PCR反應以滅菌超純水模板作為空白對照，以松材線蟲基因組DNA為陽性對照。

PCR反應體系：10×Ex Taq Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1μL，上、下游引物（10μmol／L）各0.5μL，競爭引物（10μmol／L）分別加1、2、3、4、5μL，模板DNA 1μL，Ex Taq 酶（5U／μL）0.25μL，ddH2O補足至體積25μL，隨后進行PCR擴增。PCR反應條件同1.3，擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳和試紙條檢測。

1.6 PCR擴增產物兩種檢測方法的靈敏度測試

將松材線蟲陽性對照PCR擴增產物分別用滅菌ddH2O稀釋1、2、10、20、100、200、1000倍，每個稀釋梯度各取稀釋后產物5μL進行瓊脂糖凝膠電泳及試紙條檢測，分別在凝膠成像系統、試紙條上觀察并記錄結果。

2 結果及分析

2.1 松材線蟲基因組DNA引物特異性試驗

分別提取表1中所列松材線蟲基因組DNA，應用松材線蟲特異引物對 Bx－F3－bio、Bx－B3－fit進行PCR擴增、凝膠電泳檢測，結果如圖1所示，只有第14、15、16和17泳道分別是松材線蟲 BxUs1、Bx－Us2、BxJs1和BxJs2基因組DNA擴增出片段大小197bp的條帶，與預期結果一致，同時，空白對照、兩種植物、兩種真菌及8種線蟲種群陰性對照樣本均無擴增產物，說明引物對Bx－F3－bio、Bx－B3－fit具有良好的特異性。

圖1 松材線蟲特異引物PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR products with specific primers for B.xylophilus

2.2 PCR擴增中競爭引物比例的篩選

上、下游引物與競爭引物的比例、擴增體系見材料與方法1.5，每組不同比例引物以水為空白對照、松材線蟲BxUs1為陽性對照模板進行擴增，產物分別用電泳及試紙條檢測，從圖2A凝膠電泳結果可以看出，空白對照（A－a1、A－b1、A－c1、A－d1和 A－e1）未見擴增產物，說明加入競爭引物對松材線蟲擴增特異性沒有影響，但隨著競爭引物所占比例逐漸升高，電泳特異性條帶的亮度逐漸減弱（圖2中A－a2、A－b2、A－c2、A－d2和 A－e2），說明隨著競爭引物濃度上升，PCR擴增產物的量逐漸減少；從圖2－B試紙條檢測結果可以看出，在競爭引物比例等于或低于0.5∶0.5∶3時，空白對照會出現假陽性結果（圖2中B－a1、B－b1、B－c1），隨著競爭引物比例達到或大于0.5∶0.5∶4時候，空白對照中假陽性結果隨即消失（圖2中B－d1、B－e1），同時對陽性對照的條帶清晰度無影響（圖2中B－d2、B－e2），綜合以上分析，確認上、下游引物與競爭引物的比例為 D組（0.5∶0.5∶4），在消除試紙條試驗假陽性結果的同時保證擴增產物的量，因此將其作為最適篩選比例，進行后續試驗。

圖2 不同競爭引物比例的松材線蟲特異引物PCR擴增產物電泳圖和試紙條圖Fig.2 Gel electrophoresis and nucleic acid strip assay of PCR products amplified with different proportions of the competitive primer to the specific primers for B.xylophilus

2.3 PCR擴增產物兩種檢測方法的特異性測試

用材料與方法1.5中D組（上游引物、下游引物、競爭性物比例為0.5∶0.5∶4）進行PCR擴增，以水為空白對照、以Zm1、Lb1兩種植物、Ag1、Fg1兩種真菌、BmJs1BmJs2BmSk1BmSk2BdSk1BFSk1、BrSk1、Auk等8種線蟲種群為陰性對照，以及BxUs1、BxUs2、BxJs1、BxJs2等松材線蟲為陽性對照，取擴增產物進行試紙條檢測（圖3），從檢測結果可以看出，只有松材線蟲陽性對照擴增產物出現特異性紅色條帶，其余空白對照及其他各陰性對照在檢測線位置均無條帶出現，顯示了該檢測方法良好的特異性。

圖3 松材線蟲試紙條檢測方法特異性檢測Fig.3 The specificity of nucleic acid strip assay of B.xylophilus

2.4 PCR擴增產物兩種檢測方法的靈敏度測試

用凝膠電泳檢測時，PCR擴增產物10倍時，用肉眼難以看見清晰的特異性條帶（圖4A），當擴增產物稀釋隨著松材線蟲PCR擴增產物濃度的降低，特異性條帶的亮度也逐漸下降；而試紙條檢測法中（圖4B），同樣稀釋梯度，同樣上樣量的情況下，當松材線蟲PCR擴增產物稀釋1000倍后，僅憑肉眼仍能觀察到清晰的陽性檢測線，因此核酸試紙條檢測的靈敏性要遠遠高于普通凝膠電泳檢測法。

圖4 凝膠電泳檢測法和試紙條法檢測靈敏度比較Fig.4 Sensitivity comparison of gel electrophoresis and NADA

3 討論

本研究通過將聚合酶鏈式反應（PCR）與核酸試紙條檢測方法相結合，首次建立了一種核酸試紙條可視化檢測松材線蟲的方法，無需凝膠電泳檢測PCR擴增產物所需要的制膠、電泳、成像等步驟，將2h的檢測時間縮短為10min，大大提高了檢測效率，靈敏度試驗結果表明核酸試紙條法的檢測靈敏度比傳統電泳凝膠成像高50倍以上，同時該方法檢測完后只產生少量的紙質垃圾，處理簡單，對環境友好，而凝膠電泳法檢測結束后，產生染色凝膠及塑料手套，處理困難，后期處理成本也高。

用凝膠電泳法檢測PCR擴增產物時，出現引物間二聚體（cross dimers，CDs）對擴增結果的檢測不會發生影響，但是應用核酸試紙條法時，如果不消除兩側同時帶有標記物的引物二聚體，就會不可避免地出現假陽性結果，對檢測結果產生影響［16－17］，而特異引物的區段是特定的序列，通過改變引物本身消除引物二聚體存在一定的局限性，本研究在PCR反應體系中加入一定比例的競爭引物（competitive oligonucleotide primer，COP），用于防止帶標記的上、下游引物間形成引物二聚體，從而消除帶標記引物二聚體的形成，可以很好地消除假陽性對試驗結果的影響。

本研究中應用的可視化試紙條檢測方法與松材線蟲已有的普通PCR電泳法、ITS－PCR－RFLP法和實時熒光PCR技術相比，儀器、成本大大降低，檢測時間上耗時更短，提高了出入境口岸松材線蟲的鑒定工作效率，能更好地適應進出口貿易快速通關的要求，所使用的PCR產物檢測試紙條是個通用型試紙條，可以廣泛應用于PCR診斷試劑的開發，該檢測方法無需電泳儀、凝膠成像儀等儀器設備投入，應用成本低，對于PCR檢測方法在基層實驗室的推廣應用將有著巨大的推動作用。

可視化快速核酸試紙條法具有操作便利、特異性強、靈敏度高，結果直觀、穩定、可靠、對環境友好等多項優點，適合口岸檢疫實驗室進行松材線蟲的快速篩查。

［1］ 祝列克.要重視和防范外來有害生物的入侵危害［J］.中國森林病蟲，2002，21（6）：36－39.

［2］ Xie Bingyan，Cheng Xinyue，Shi Juan，et al.Mechanisms of invasive population establishment and spread of pinewood nematodes in China［J］.Science in China Series C：Life Sciences，2009，52（6）：587－594.

［3］ 劉源崗，龍瑞敏.松材線蟲的快速檢測［J］.安徽農業科學，2007，35（28）：8926－8928.

［4］ 趙立榮，廖金鈴，鐘國強.松材線蟲和擬松材線蟲的PCR快速檢測［J］.華南農業大學學報，2005，26（2）：59－61.

［5］ 陳鳳毛，葉建仁，吳小芹.應用特異引物組合檢測松材線蟲［J］.林業科技開發，2006，20（3）：14－16.

［6］ Chen Fengmao，Ye Jianren，Tang Jian，et al.Discrimination of Bursaphelenchus xylophilus and Bursaphelenchus mucronatus by PCR－RFLP technique［J］.Frontiers of Forestry in Chi－ｉｎａ，２００７，２（１）：８２－８６.

［7］ 葛建軍，曹愛新，劉先寶，等.應用TaqMan－MGB探針進行松材線蟲的實時熒光定量檢測技術研究［J］.植物病理學報，2005，35（6）：52－58.

［8］ 郭立新，段維軍，顧建鋒，等.木質包裝中松材線蟲的實時熒光PCR檢測［J］.植物檢疫，2011，37（5）：129－134.

［9］ Cao A X，Liu X Z，Zhu S F，et al.Detection of the pinewood nematode，Bursaphelenchus xylophilus，using a real－time polymerase chain reaction assay［J］.Phytopathology，2005，95（5）：566－571.

［10］王焱，季鐳，余本淵，等.3種松材線蟲分子檢測技術的比較分析［J］.南 京 林 業 大 學 學 報 （自 然 科 學 版），2007，31（4）：128－132.

［11］Brada D，Roth J.“Golden blot”—detection of polyclonal and monoclonal antibodies bound to antigens on nitrocellulose by protein A－gold complexes［J］.Analytical Biochemistry，1984，142（1）：79－83.

［12］Rendong Fang，Xia Li，Lin Hu，et al.Cross－priming amplification for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，2009，47（3）：845－847.

［13］Wu L T，Curran M D，Ellis J S，et al.Nucleic acid dipstick test for molecular diagnosis of pandemic H1N1［J］.Journal of Clinical Microbiology，2010，48（10）：3608－3613.

［14］張永樂，厲小玉，潘克女，等.甲型H1N1流感病毒快速診斷核酸試紙條的研制及應用［J］.中華醫院感染學雜志，2011，21（14）：2871－2873.

［15］汪琳，羅英，周琦，等.柏亞鐸核酸試紙條在檢測轉EPSPS基因作物中的應用［J］.生物技術通訊，2011，22（2）：238－242.

［16］潘克女，張永樂，張輝.核酸試紙條法檢測HBV基因型方法的建立［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2010（8）：768－770.

［17］楊賢，黃歡，殷竹君，等.高靈敏可視化核酸試紙條法快速檢測HBV DNA［J］.現代生物醫學進展，2011，11（7）：1277－1281.