甘肅省白銀市保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲病病原鑒定

柳永娥， 李惠霞＊， 馬金慧， 楊成德， 張廣榮

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，蘭州 730070；2.甘肅省白銀市植保站，白銀 730900）

根結(jié)線蟲是一種永久性的內(nèi)寄生病原線蟲，能夠?qū)υS多作物造成嚴(yán)重?fù)p害，具有廣泛的地理分布和寄主范圍，一旦侵入，會(huì)在土壤中長期存在，難以根除［1］。北方保護(hù)地蔬菜的種植為其創(chuàng)造了良好的寄生條件，使其在北方保護(hù)地中的傳播和危害日益嚴(yán)重。甘肅省白銀市保護(hù)地蔬菜種植面積廣，僅白銀區(qū)設(shè)施蔬菜種植面積達(dá)1980hm2，蔬菜種植種類主要為番茄、黃瓜、豇豆、茄子等，都是根結(jié)線蟲的良好寄主。由于多年連作，或上述蔬菜之間輪作，使得根結(jié)線蟲的防治更加困難，根結(jié)線蟲已成為白銀市具有重要經(jīng)濟(jì)性的病原線蟲。由于線蟲不同的種間存在顯著的致病性差異，因此根結(jié)線蟲種的鑒定是防治的基礎(chǔ)，本文通過形態(tài)學(xué)結(jié)合同工酶測定對白銀市保護(hù)地蔬菜主要種植區(qū)的根結(jié)線蟲種類進(jìn)行了鑒定，以期為防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2012年5月－7月在白銀市保護(hù)地蔬菜主要種植區(qū)靖遠(yuǎn)縣平堡鄉(xiāng)、東灣鎮(zhèn)、北灣鄉(xiāng)和白銀區(qū)強(qiáng)灣鄉(xiāng)、水川鎮(zhèn)及平川區(qū)寶積鄉(xiāng)等采集了番茄、黃瓜、豇豆等幾種蔬菜的根結(jié)線蟲病根樣（如表1所示），帶回實(shí)驗(yàn)室，直接解剖獲得雌蟲，備用。其余病根樣4℃保存。

表1 白銀市蔬菜根結(jié)線蟲樣本采集信息Table 1 Information of root－knot nematode samples collected from greenhouse vegetables in Baiyin City

1.2 會(huì)陰花紋的制作

參考馮志新的方法制作會(huì)陰花紋［2］，會(huì)陰花紋制作好后在Nikon顯微鏡下觀察并拍照，初步判斷根結(jié)線蟲的種類。

1.3 同工酶分析

1.3.1 兩種同工酶的提取

酶浸提液為質(zhì)量濃度20%蔗糖和2%Triton－100［3］，每個(gè)種群分別制作5條雌蟲和單條雌蟲的酶浸提液樣，每樣重復(fù)3次，5條雌蟲加入50μL酶浸提液，單條雌蟲加入20μL，然后用自制尖頭磨面玻璃棒研碎雌蟲，－20℃過夜使用或冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳儀為DYY－5型，垂直板電泳槽為DYCZ－30型，凝膠板大小105mm×185mm，凝膠厚度1mm。分離膠和濃縮膠濃度分別為7.5%和3%，電極緩沖液為pH8.3的Tris－甘氨酸緩沖液。用20μL移液槍加樣，每孔加15μL樣品和5μL 1%溴酚藍(lán)溶液，80V下電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)兩膠邊界，120V電泳至溴酚藍(lán)距底部1cm處，結(jié)束電泳。

1.3.3 染色

參考陳永芳等的方法［4］染色。電泳結(jié)束后，取下凝膠，在37℃黑暗條件下染色，蘋果酸脫氫酶（MDH）染色8～10min，酯酶（EST）染色30min。染色完畢后，蒸餾水沖洗干凈，立即用10%的醋酸溶液固定1～3h，后用蒸餾水沖洗干凈，并拍照保存。根據(jù)染色結(jié)果判讀MDH和EST譜型，參照Esbenshade和 Triantaphyllou［4］的根結(jié)線蟲酯酶和蘋果酸脫氫酶的電泳譜型標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算兩種酶的相對遷移率（Rf值），確定根結(jié)線蟲的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 會(huì)陰花紋的觀察

試驗(yàn)結(jié)果表明，靖遠(yuǎn)縣6個(gè)根結(jié)線蟲群體和白銀區(qū)、平川區(qū)10個(gè)根結(jié)線蟲群體的會(huì)陰花紋基本一致，具有如圖1所示的特征（圖1a、b），背弓高而方，線紋大多平滑，亦有波浪狀線紋，無側(cè)線。初步鑒定為南方根結(jié)線蟲。

靖遠(yuǎn)縣8個(gè)根結(jié)線群體和白銀區(qū)1個(gè)根結(jié)線蟲群體會(huì)陰花紋形態(tài)相似，背弓低圓或略高，線紋平滑，兩條側(cè)線明顯，從尾區(qū)向外延伸，略呈“八”字形或基本在同一水平線上，有些尾端有明顯的“渦”，如圖1c、d所示。初步鑒定為爪哇根結(jié)線蟲。

圖1 白銀市蔬菜根結(jié)線蟲群體雌蟲會(huì)陰花紋形態(tài)圖Fig.1 Illustration of perineal patterns of root－knot nematode populations on vegetables in Baiyin City

2.2 同工酶測定

經(jīng)同工酶電泳圖譜觀察，采自白銀市的25個(gè)蔬菜根結(jié)線蟲群體的蘋果酸脫氫酶無論是多雌樣品還是單雌樣品表型完全一致，均為N1型（圖2、圖3），Rf值為0.24。酯酶圖譜觀察結(jié)果顯示，靖遠(yuǎn)縣6個(gè)根結(jié)線蟲群體和白銀區(qū)、平川區(qū)10個(gè)根結(jié)線蟲群體多雌樣和單雌樣的酯酶圖譜具有一致的表型，均為I1型（圖2），Rf值為0.44，而其他8個(gè)靖遠(yuǎn)縣根結(jié)線群體和1個(gè)白銀區(qū)根結(jié)線蟲群體酯酶圖譜一致為J3型（圖3），Rf值分別為0.44、0.52、0.56。

圖2 南方根結(jié)線蟲的同工酶表型Fig.2 MDH－EST phenotypes of single females of M.incognita

圖3 爪哇根結(jié)線蟲的同工酶表型Fig.3 MDH－EST phenotype of single females of M.javanica

將以上酯酶和蘋果酸脫氫酶譜型觀察結(jié)果和Rf值測量結(jié)果與Esbenshade和Triantaphyllou［4］的根結(jié)線蟲酯酶和蘋果酸脫氫酶的電泳譜型標(biāo)準(zhǔn)相比較，將靖遠(yuǎn)縣的6個(gè)群體鑒定為南方根結(jié)線蟲，8個(gè)群體鑒定為爪哇根結(jié)線蟲，白銀區(qū)和平川區(qū)的10個(gè)群體為南方根結(jié)線蟲，1個(gè)群體為爪哇根結(jié)線蟲。此判定結(jié)果與會(huì)陰花紋的鑒定結(jié)果一致，且每一群體均為單一群體，同一個(gè)大棚或溫室中無復(fù)合侵染現(xiàn)象。

3 討論

本研究利用形態(tài)學(xué)鑒定與同工酶技術(shù)相結(jié)合的方法鑒定出白銀市部分蔬菜根結(jié)線蟲群體為爪哇根結(jié)線蟲，部分群體為南方根結(jié)線蟲。這是首次在甘肅省發(fā)現(xiàn)爪哇根結(jié)線蟲。爪哇根結(jié)線蟲因其具有典型的會(huì)陰花紋特征和酯酶譜帶類型，在鑒定中僅依據(jù)這兩個(gè)特征就可達(dá)到準(zhǔn)確鑒定的目的。Esbenshade和Triantaphyllou曾證明有94%的北方根結(jié)線蟲，98%的南方根結(jié)線蟲及100%的爪哇根結(jié)線蟲僅依據(jù)其酯酶譜帶就能確定其種類［4］，且現(xiàn)已證實(shí)根結(jié)線蟲種的酯酶譜帶特異性很穩(wěn)定，可以用于4種常見根結(jié)線蟲的鑒定。自2002年劉培磊首次在普通的電泳設(shè)備上實(shí)現(xiàn)單個(gè)雌蟲蘋果酸脫氫酶和酯酶兩種同工酶的分離以來［5］，已有眾多研究者將其應(yīng)用于根結(jié)線蟲的鑒定中，這為根結(jié)線蟲的快速鑒定奠定了基礎(chǔ)。

南方根結(jié)線蟲（M.incognita）、花生根結(jié)線蟲（M.arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲（M.javanica）和北方根結(jié)線蟲（M.hapla）是引起蔬菜根結(jié)線蟲的主要病原［6］，據(jù)相關(guān)報(bào)道南方根結(jié)線蟲是危害我國蔬菜的優(yōu)勢種群［7－12］。在甘肅省蔬菜根結(jié)線蟲的報(bào)道中，高赟、漆永紅等通過形態(tài)學(xué)鑒定出南方根結(jié)線蟲是危害河西地區(qū)番茄和黃瓜的病原［13－14］。由于根結(jié)線蟲不同種之間存在顯著的致病性差異［15］，因此準(zhǔn)確鑒定根結(jié)線蟲種類是防治的前提。甘肅省蔬菜根結(jié)線蟲種類研究尚不全面，目前報(bào)道的只有河西地區(qū)的線蟲種類，甘肅省氣候條件和地理環(huán)境差異很大，其他地區(qū)的根結(jié)線蟲群體還有待于進(jìn)一步的鑒定。樣品的快速鑒定顯得尤為重要，通過蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行蘋果酸脫氫酶和酯酶的測定不失為一種簡便、快速的鑒定方法，會(huì)陰花紋結(jié)合同工酶測定與單純的形態(tài)學(xué)鑒定相比更為準(zhǔn)確和可靠。

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