加工番茄病毒病田間發(fā)生情況及毒原的分子檢測

都業(yè)娟， 石寶萍， 李成亮， 向本春

（新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

新疆是我國最大的加工番茄種植和加工基地，占全國生產(chǎn)能力的90% 以上。近年來，新疆石河子、瑪納斯、奎屯、博樂等地每年6－8月加工番茄病毒病害發(fā)生普遍，田間癥狀復(fù)雜，部分地塊發(fā)病率高達(dá)100%，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至造成全田絕產(chǎn)。2003年農(nóng)五師八十四團(tuán)種植加工番茄404hm2，100%的植株都感染了病毒，其中絕產(chǎn)面積達(dá)到40.3hm2［1］。

番茄病毒病田間癥狀主要表現(xiàn)為花葉、線葉和壞死條斑癥狀，尤以壞死條斑的危害最大。研究表明，煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、馬鈴薯X 病毒（Potato virus X，PVX）、馬鈴薯 Y病毒（Potato virus YPVY 番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）以及CMV 與Tobamovirus復(fù)合侵染為引起番茄病毒病的主要病原［2－3］。姜玉霞明確新疆加工番茄花葉癥狀主要由ToMV引起［4］；常波研究表明TMV與CMV復(fù)合侵染可引起加工番茄表現(xiàn)壞死條斑癥狀［5］；許文博通過血清學(xué)方法證明 ToMV、CMV 和蠶豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus，BBWV）復(fù)合侵染可能是造成田間壞死條斑病的主要因素［6］。

本研究針對加工番茄病毒病進(jìn)行研究，明確3種病害癥狀的田間發(fā)生特點(diǎn)；針對危害最重的壞死條斑病，通過對主栽品種‘里格87－5’進(jìn)行不同播期發(fā)病情況的調(diào)查及新疆15個主要加工番茄品種發(fā)病情況的比較，明確播期與該病害的關(guān)系及品種間發(fā)病的差異；同時通過分子檢測查明其田間毒原的復(fù)合侵染情況，從而為該病害的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試加工番茄品種

‘新番4’、‘新番9’、‘石番3’、‘石番4’、‘石番8’、‘石番9’、‘石番98－1’、‘石番15’、‘石番18’、‘石番20B’、‘AS9081’、‘美國世紀(jì)紅’、‘里格87－5’、‘屯河34’和‘Q027’共15個品種。

1.1.2 用于PCR擴(kuò)增的引物及酶

TMV、ToMV、CMV、PVY、BBWV檢測引物分別為 TA／TB、ToA／ToB、CMV1／CMV2、PVY－1／PVY－2和Fab5＿1F／Fab5＿1R，引物序列見表1；5種病毒質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。AMV逆轉(zhuǎn)酶、Taq酶及其他PCR相關(guān)試劑均購自TaKaRa公司。

表1 用于PCR檢測的引物序列Table 1 Sequences of the primers used for PCR

1.2 方法

1.2.1 田間種植方法

播期試驗(yàn)：石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站內(nèi)，分別于2007、2008、2009年4月5日（早播期）、4月25日（適播期）和5月20日（晚播期）三個時間，分期播種‘里格87－5’，每個播期分別播種4膜8行，約200株。

品種試驗(yàn)：石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站內(nèi)，于2009年5月20日，分別播種15個番茄品種，每品種播種2膜4行，約100株，共設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 病害調(diào)查方法

不同播期發(fā)病情況調(diào)查：分別于2007、2008、2009年7月28日、8月2日、7日、12日和17日對3個播期所有番茄株調(diào)查壞死條斑病的發(fā)病率及病情指數(shù)，取3年平均值進(jìn)行分析，并對病情指數(shù)調(diào)查數(shù)據(jù)用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

不同品種發(fā)病情況調(diào)查：分別于2009年7月28日、8月2日、7日、12日、17日調(diào)查所種植的15個品種番茄壞死條斑病的發(fā)病率及病情指數(shù)，取3個重復(fù)的平均值進(jìn)行比較，并對8月17日3個重復(fù)的病情指數(shù)用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

病情指數(shù)調(diào)查依據(jù)病害嚴(yán)重程度分為5級，分級標(biāo)準(zhǔn)如下。

0級：無癥狀；Ⅰ級：葉片和莖稈上有不太明顯的壞死小斑點(diǎn)；Ⅱ級：葉片和莖稈上的黑色（或褐色）的壞死斑點(diǎn)連成小片；Ⅲ級：植株莖稈病斑連成片，近2／3面積壞死干枯；Ⅳ級：植株頂端壞死（生長點(diǎn)壞死），全株干枯壞死。

發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.2.3 田間病原分子檢測樣品的采集

于2009、2010、2011、2012年8月5－7日在石河子蔬菜研究所、石河子大學(xué)試驗(yàn)站、石河子大學(xué)試驗(yàn)場、北泉鎮(zhèn)、花園鎮(zhèn)分別采集表現(xiàn)病毒病癥狀（壞死條斑癥狀為主）的病株，每點(diǎn)采集20株，每年100株，4年共檢測400株。

1.2.4 TMVToMVCMVPVYBBWV 5種病毒cDNA合成及PCR反應(yīng)體系與條件

cDNA合成：5×第一鏈合成緩沖液4μL，10mmol／L dNTP1μL，RNase Inhibitor （40U／μL）1μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶（200U／μL）1μL，隨機(jī)引物R9（50μmol／L）1μL，植物總 RNA1μL，DEPC水補(bǔ)足20μL，混勻后25℃放置10min，然后于37℃保溫1h；70℃保溫15min，以使酶失活。

PCR反應(yīng)：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP（2.5mmol／L）1.0μL，上游引物1.0μL，下游引物1μL，Taq DNA 聚合酶 （2U／μL）0.5μL，cDNA模板2.0μL，加 ddH2O 至25.0μL。預(yù)變性溫度94℃，4min；變性溫度94℃，30s，退火溫度50℃，30s，延伸溫度72℃，1min，5個循環(huán)；變性溫度94℃，30s，退火溫度55℃，30s，延伸溫度72℃，1min 30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

2 結(jié)果分析

2.1 加工番茄病毒病發(fā)生情況

2.1.1 加工番茄病毒病癥狀調(diào)查

通過2007－2012年6年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆加工番茄病毒病可表現(xiàn)花葉、線葉和條斑3種癥狀。

6月初開始出現(xiàn)花葉癥狀，田間發(fā)病率為5%～8%，僅表現(xiàn)花葉癥狀的植株后期產(chǎn)量和品質(zhì)受影響較小。

7月上旬開始出現(xiàn)線葉癥狀，發(fā)病率為3%～5%發(fā)病后植株上部不再結(jié)果，早期果實(shí)可正常成熟。

7月25日－8月1日條斑癥狀開始出現(xiàn)，至8月上旬病情迅速發(fā)展，早期上部葉片輕微黃化，葉脈壞死并逐漸擴(kuò)展成褐色壞死斑；后期番茄植株頂端壞死；沿莖表形成不規(guī)則褐色長條斑，逐漸擴(kuò)大，導(dǎo)致植株枯死；褐色條斑可危害果柄，果實(shí)明顯畸形，表皮散布不規(guī)則壞死斑，果實(shí)內(nèi)部組織壞死，幼果、成熟果均可發(fā)病。該癥狀發(fā)病晚但病情擴(kuò)展迅速，重病田發(fā)病率高達(dá)100%，并可造成全田絕產(chǎn)。

2.1.2 不同播期加工番茄壞死條斑病發(fā)病情況

分別對2007、2008、2009年早播期、適播期和晚播期的加工番茄進(jìn)行發(fā)病率及病情指數(shù)的調(diào)查，結(jié)果顯示：發(fā)病率和病情指數(shù)均表現(xiàn)為晚播＞早播＞適播，晚播明顯有利于條斑病的發(fā)生，表現(xiàn)為發(fā)病率高，植株受害嚴(yán)重，其發(fā)病率及病情指數(shù)分別達(dá)到67.94%和43.47。3個播期中適播期番茄發(fā)病率最低，植株受害最輕，發(fā)病率和病情指數(shù)分別為11.00%和8.46。且3個播期番茄均表現(xiàn)為7月28日至8月2日發(fā)病率迅速增高，8月2日至7日病情指數(shù)迅速增高，之后表現(xiàn)為逐漸增高（表2、圖1、圖2）。對5次調(diào)查的病情指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，顯示在0.05水平上，從8月7日開始，早播、適播、晚播之間存在顯著性差異。

表2 不同播期加工番茄壞死條斑病田間發(fā)生情況Table 2 Survey of necrotic stripe disease on processing tomato in different sowing times

2.1.3 不同品種加工番茄壞死條斑病發(fā)病情況

采用1.2.2不同品種發(fā)病情況調(diào)查方法，對15個品種加工番茄的發(fā)病率及病情指數(shù)進(jìn)行調(diào)查比較，結(jié)果顯示：加工番茄壞死條斑病自2009年7月28日開始出現(xiàn)，至8月2日，所有品種的發(fā)病率均高于50%，之后各品種發(fā)病率呈現(xiàn)隨時間逐漸升高，至8月17日，發(fā)病率高達(dá)75.21%～82.33%；病情指數(shù)的調(diào)查顯示，7月28日15個品種的病情指數(shù)為2.19～4.71，至8月7日則高達(dá)39.48～55.71，之后病情指數(shù)呈現(xiàn)逐漸升高趨勢（表3、圖3、圖4）。

對8月17日各品種的病情指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明在0.05水平，‘里格87－5’、‘石番15’、‘屯河34’、‘石番18’與‘石番20B’、‘石番8’、‘石番4’、‘新番9’、‘新番4’、‘Q027’、‘石番3’存在顯著性差異；‘美國世紀(jì)紅’、‘AS9081’與‘石番4’、‘新番9’、‘新番4’、‘Q027’、‘石番3’存在顯著性差異；‘石番98－1’、‘石番9’與‘新番9’、‘新番4’、‘Q027’、‘石番3’存在顯著性差異。15個品種中，‘里格87－5’、‘石番15’、‘屯河34’、‘石番18’田間發(fā)病較重；‘新番9’、‘新番4’、‘Q027’、‘石番3’田間發(fā)病相對較輕。

表3 加工番茄不同品種壞死條斑病田間發(fā)生情況Table 3 Survey of necrotic stripe disease on processing tomato of different cultivars

圖3 不同調(diào)查時間各品種發(fā)病率Fig.3 Incidence rate of each cultivar in different survey times

2.2 加工番茄病毒病田間病原的分子檢測

利用 TMV、ToMV、CMV、PVY、BBWV 5種病毒的特異性引物，參照1.2.4方法，建立其有效檢測體系（圖5）。利用該體系對供試田間樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：所有病株均可檢測到病毒，其中TMV的侵染率為2.50%，ToMV的侵染率為88.75%，CMV的侵染率為71.25%PVY的侵染率為64.75%、BBWV的侵染率為52.50%。各病毒的單一侵染率及2種病毒的復(fù)合侵染率均較低，而以CMV、BBWV和PVY 3種病毒中的2種分別與ToMV復(fù)合侵染率最高，分別為28.25%、20.75%和15.25%。因此加工番茄病毒病田間主要由多種病毒復(fù)合侵染引起（圖6）。

圖4 不同調(diào)查時間各品種病情指數(shù)Fig.4 Disease index of each cultivar in different survey time

圖5 加工番茄病毒病田間樣品的分子檢測Fig.5 Molecular detection of viruses on processing tomato in the field

圖6 加工番茄田間病株毒原復(fù)合侵染情況Fig.6 The mixed infection of viruses on processing tomato in the field

3 結(jié)論與討論

番茄病毒病在我國各地均有發(fā)生，其中尤以壞死條斑病毒病危害最大。新疆作為我國加工番茄主產(chǎn)區(qū)，該病害的發(fā)生極大地影響了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過連續(xù)3年對加工番茄不同播期發(fā)病率及病情指數(shù)的調(diào)查，明確晚播十分有利于該病害的發(fā)生，而適期播種可有效減輕該病害發(fā)生。同時通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同年份該病害發(fā)生程度存在較大的差異，2009年病害發(fā)生較2007、2008年明顯偏重。

對15個主要加工番茄品種在有利病害發(fā)生的晚播條件下進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，所有品種均可發(fā)病，至病害后期（8月17日），發(fā)病率高達(dá)75.21%～82.33%；病情指數(shù)調(diào)查分析顯示‘里格87－5’、‘石番15’、‘屯河34’、‘石番18’4個品種田間發(fā)病較重；‘新番9’、‘新番4’、‘Q027’、‘石番3’四品種田間發(fā)病相對較輕?！锔?7－5’作為目前新疆加工番茄的主栽品種，對病毒病抗性較差，不利于該病害的有效控制。

通過對病樣5種病毒的分子檢測，表明侵染加工番茄的Tobamovirus病毒主要是ToMV，而不是TMV，這與周雪平的研究結(jié)果一致［7］；同時加工番茄病毒病田間發(fā)病主要以病毒的復(fù)合侵染為主，尤其是ToMV與CMV、PVY、BBWV中任意2種病毒的組合，其侵染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)侵染。ToMV可通過種子和田間機(jī)械摩擦傳播，而CMV、PVY、BBWV田間主要通過蚜蟲等昆蟲介體進(jìn)行傳播。播期和品種試驗(yàn)均表明7月末至8月初為壞死條斑病發(fā)生的關(guān)鍵時期，發(fā)病率迅速上升，8月上旬則是該病害產(chǎn)生危害的重要時期，這是否是受到7月上、中旬石河子地區(qū)蚜蟲遷飛的影響，病毒在潛伏期后集中暴發(fā)，有待進(jìn)一步研究。

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