miRNA在腫瘤早期診斷中的價值及其檢測技術進展

徐 怡，陳光明，宓現強

(1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093;2.中國科學院上海高等研究院，上海 201210)

惡性腫瘤是一種死亡率很高的疾病，2005年全球死亡人數5800萬中死于癌癥的760萬，占總數13%[1-2]。據世界衛生組織最近發表《世界癌癥報告》說，今后數年將是全球癌癥高發年份，如各國不采取緊急措施，到2020年全世界癌癥發病率將比現在增加50%，全球每年新增患者人數將達1500萬人。解決腫瘤高死亡率的途徑之一是對腫瘤進行有效的控制和預防，而控制和預防最大的難題是如何能盡可能早的發現腫瘤，從而針對性的采用最有效的手段進行治療。

腫瘤患者死亡率的不斷升高，使得越來越多的研究人員致力于腫瘤研究，在其診斷和治療方面取得了不少進展，其中腫瘤診斷方面，miRNA作為一種新的腫瘤標志物是腫瘤診斷研究的熱點。

一、腫瘤標志物的新熱點——miRNA及其檢測技術

1.miRNA簡介及優勢 miRNA(microRNA，微小RNA)是在真核生物中發現的一類內源性的非編碼小分子RNA，存在于不同生物中，在Drosha R Nase的作用下由pri-miRNA剪切成為70～100個核苷酸長度的具有莖環結構的pre-miRNA，pre-miRNA在Dicer酶作用下被剪切成19～25個核苷酸長度的成熟 RNA，即 miRNA[3]。成熟miRNA通過與目標mRNA的3'端非編碼區(3'untranslated region，3'UTR)特異性互補，導致mRNA翻譯受到抑制[4]。miRNA具有廣泛的基因調節功能，據統計miRNA調節了人類30%基因功能[3]，參與了一系列生命活動，包括細胞增殖及凋亡、器官形成、造血過程、發育進程等，與腫瘤的發生、診斷、治療和預后等有著密切關系，腫瘤中超過50%的miRNAs基因位于染色體脆性位點或染色體擴增、缺失或轉位區域[5]，相比于蛋白質標志物，miRNA表達異常出現的更早(圖1)，對早期診斷更加有利，也更適合作為作為腫瘤診斷標志物，從而成為研究熱點之一[6-8]。

圖1 腫瘤過程及生物標志物的確定

腫瘤標志物檢測是真正能夠實現腫瘤早期診斷的方法，miRNA的診斷優勢從以下實驗事例中有充分體現，Maitra A等[9]的一項研究表明血清中miRNA能很好的區分腫瘤患者和健康人群，這為在血漿或血清中檢查miRNA表達的變化情況，為基于血液樣品的人類癌癥檢測提供了依據。Mitchell，P.S 等[10]試圖通過實驗方法確定來源于血漿和血清樣本的miRNA是否會有本質的不同，該實驗組的檢測樣本來自同一患者的同一次抽血。實驗結果表明無論對血漿還是血清樣本進行檢測，miRNA都可以作為基于血液檢測的穩定的標志物。Keller等[11]對臨床454例不同疾病患者血清樣本進行芯片分析，包括肺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胃癌、腎母細胞瘤、胰腺腫瘤等腫瘤患者以及對照個體。結果顯示863種miRNAs中有多達62種miRNA在6種疾病中表達下調;24種miRNA在14種疾病中表達下調;同時也有121種miRNA在所有的14種疾病中正常表達。這一研究結果說明miRNA對于腫瘤有很好的顯示作用，使得根據血清中miRNA的表達情況確定患者患病情況成為可能。Hennessey，P.T等[12]針對非小細胞肺癌的實驗結果發現血清中的2種miRNA:miR-15b和miR-27b的不同表達情況能夠很好的區分非小細胞肺癌和健康人群，并且特異性很高。該研究結果不僅證實了前人對于循環miRNA對篩查非小細胞肺癌有很重要的作用[12-14]的結論.同時也充分顯示血清中miRNA的不同表達情況對于非小細胞肺癌來說具有很高的診斷價值，并且可能成為患者確診前的最有效的診斷依據。上述幾例實驗充分證明miRNA是特異性很強的腫瘤早期診斷標志物。Rui Liu等[15]用197例胰腺癌血清樣本，對胰腺癌早期標志物進行研究，結果顯示該研究組所選擇的7種miRNA同時檢測的準確率為86.3%，而單獨的糖類抗原(CA)19-9檢測準確率為56.4%，癌胚抗原(CEA)僅為36.4%。這充分說明miRNA相比于蛋白類標志物具有優勢，也從另一方面說明多個靶分子同時檢測的重要性。

從上述實驗事例可以看出miRNAs表達異常對腫瘤有很好的鑒別作用[5，16-17]。這為腫瘤實現早期診斷提供了方向。miRNA不僅在腫瘤的發生發展過程中起到了重要的作用，可以作為癌癥診斷和預后判斷的重要標志物。同時miRNA具有以下五大優點:(1)miRNA在正常人外周血中表達穩定且可以穩定存在，無顯著的個體差異[18-21];(2)血清或血漿中miRNA在室溫下孵育24 h或者以上、反復凍融(可高達8個凍融周期)、過酸、過堿、甚至煮沸條件下不易降解[22-28，10];(3)miRNA 表達水平的變化與惡性腫瘤的病理過程密切相關;(4)血清中miRNA的異常表達可作為腫瘤細胞存在的直接證據，具有很好的生物學標志物價值[29-31];(5)miRNA相比于蛋白標志物不僅檢測準確率更高，且更易于實現多組分同時檢測，優越性明顯。

2.生物信息學在miRNA標志物發現及優化中的作用 近年來隨著對miRNA研究的增多，不同物種中數以百計的miRNA已直接由克隆技術和計算方法確定，但是仍有很多miRNA由于相對分子質量較小或者序列特異性等問題不能僅僅依靠序列信息就可以確定，而是需要了解miRNA前體的結構信息才可以確定[32-33]。生物信息學在這方面是一種非常有價值的研究方法[34]。生物信息學通過計算機和信息技術結合，對生物實驗數據進行分析和計算，對于實驗方法實驗結果是一種非常有價值的補充。Mizuguchi，Y等[35]研究表明通過生物信息學所確定的miRNA相比于個體miRNA研究或者其他臨床病理研究等方法，對于高危人群的預后狀況分析效果更好。因此生物信息學技術能夠成為生物知識和臨床治療之間相結合的橋梁。生物信息學及其相關技術能夠促進新的靶點的快速識別，從而可以推進研究更快的進入到實驗驗證階段[36]。

同時生物信息學在多靶點的確定方面有著不可忽視的作用。目前臨床上對于腫瘤標志物診斷方法仍多為單組份檢測，而單組份檢測存在特異性不高、靈敏度不強等缺陷，多組分同時檢測恰恰能夠克服單組份檢測的缺陷，靈敏度和特異性都有很大的提高。本文前面所提到Rui Liu等的實驗數據也說明多組分相比于單組份的優勢，而尋找同時檢測的多組分靶點也成為了非常重要的一部分，生物信息學對于新型標志物miRNA的確定以及多靶點的組合方面有重要作用，根據生物信息學計算結果結合相關驗證實驗可以更快的確定腫瘤標志物最佳組合，從而更快的推動腫瘤標志物多組分同時檢測。

3.用于腫瘤早期診斷的miRNA檢測技術 在腫瘤的早期診斷中，除了標志物的選擇和檢測樣本的確定外，檢測方法也是提高腫瘤檢測特異性的一個很重要方面。目前miRNA的檢測有以下幾種方法，熒光定量聚合酶鏈反應(RTPCR)、熒光原位雜交(FISH)等。其中RT-PCR檢測方法最為常用，主要分為探針法和染料法2種，由于miRNA在血清中濃度低，因此反應所需循環次數多，持續時間長。目前國內腫瘤核酸定量檢測試劑盒仍處于科學研究階段;FISH相對簡單，國內外已有腫瘤組織細胞檢測試劑盒，然而miR-NAs原位檢測系統相對較少，主要的原因是低拷貝、片段小。

分子信標檢測技術是能夠實現對miRNA進行簡便快速檢測的檢測方法。分子信標是一段寡核苷酸，主要由4個部分組成:環、莖、熒光基團和猝滅基團，分子信標具有能夠很好的和靶點miRNA特異性結合的特點，因此只有當檢測樣本中存在檢測靶點，分子信標才會與之結合，與此同時，分子信標熒光基團和猝滅基團打開，從而可以檢測到熒光的存在。這一特點使得檢測的特異性大大提高。普通分子信標常用的熒光基團和猝滅基團為傳統有機染料，但是有機染料存在著吸收光譜較寬，而發射光譜較窄、抗光漂白性較差等缺點[37]。為此，近年來很多學者和專家開始更多的關注量子點技術。

量子點是一種無機納米材料，具有發光強度強，經過測定單個量子點比有機染料明亮大概10～20倍[38-39]、且具有發射波長可以由自身尺寸大小變化而變化等優點，通過不同尺寸的量子點與分子信標結合能夠實現對多種miRNA的同時檢測。將量子點和分子信標技術結合，能夠使兩者優勢互補，非常便于實現建立快速、簡便、高效的腫瘤標志物早期診斷新技術，對腫瘤的早期診斷的實現有重大的意義。

三、總結

綜上所述，腫瘤診斷方面影像學有不可忽視的作用，但是由于自身局限性很難實現早期診斷，而傳統標志物診斷由于特異性不強，靈敏度不高而影響診斷效果。檢測標志物、檢測對象及檢測方法共同決定了惡性腫瘤的早期診斷效果，miRNA、生物信息學以及分子信標檢測技術三者相結合，對于實現惡性腫瘤早期診斷有巨大的推動作用。

[1]Srinivas PR，Kramer BS，Srivastava S.Trends in biomarker research for cancer detection[J].Lancet Oncol，2001，2(11):698-704.

[2]Cho WC.Contribution of oncoproteomics to cancer biomarker discovery[J].Mol Cancer，2007，6:25.

[3]Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function[J].Cell，2004，116(2):281-297.

[4]李海明，施南峰.miRNA——一種新的調控基因表達的小分子 RNA[J].中國癌癥雜志，2006，16(8):675-678.

[5]Slack FJ，Weidhaas JB.MicroRNA in cancer prognosis[J].N Engl J Med，2008，359(25):2720-2722.

[6]Hampton T.MicroRNAs linked to pancreatic cancer[J].JAMA，2007，297(9):937.

[7]Zhang L，Coukos G.MicroRNAs:a new insight into cancer genome[J].Cell Cycle，2006，5(19):2216-2219.

[8]O'Driscoll L .The emerging world of microRNAs[J].Anticancer Res，2006，26(6B):4271-4278.

[9]Maitra A，Hruban RH.Pancreatic cancer[J].Annu Rev Pathol，2008，3:157-188.

[10]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Nat Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518.

[11]Keller A，Leidinger P，Bauer A，et al.Toward the blood-borne miRNome of human diseases[J].Nat Methods，2011，8(10):841-843.

[12]Hennessey PT，Sanford T，Choudhary A，et al.Serum microRNA biomarkers for detection of nonsmall cell lung cancer[J].PLoS One，2012，7(2):e32307.

[13]Boeri M，Verri C，Conte D，et al.MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108(9):3713-3718.

[14]Foss KM，Sima C，Ugolini D，et al.miR-1254 and miR-574-5p:serum-based microRNA biomarkers for early-stage non-small cell lung cancer[J].J Thorac Oncol，2011，6(3):482-488.

[15]Liu R，Chen X，Du Y，et al.Serum microRNA expression profile as a biomarker in the diagnosis and prognosis of pancreatic cancer[J].Clin Chem，2012，58(3):610-618.

[16]Zhu S，Wu H，Wu F，et al.MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis[J].Cell Res，2008(3)，18:350-359.

[17]Hwang JH，Voortman J，Giovannetti E，et al.Identification of MicroRNA-21 as a biomarker for chemoresistance and clinical outcome following adjuvant therapy in resectable pancreatic cancer[J].PLoS ONE，2010，5(5):e10630.

[18]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518.

[19]Chim SS，Shing TK，Hung EC，et al.Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma[J].Clin Chem，2008，54(3):482-490.

[20]Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J].Cell Res，2008，18(10):997-1006.

[21]Resnick KE，Alder H，Hagan JP，et al.The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform[J].Gynecol Oncol，2009，112(1):55-59.

[22]Meng F，Henson R，Wehbe-Janek H，et al.Micro-RNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer[J].Gastroenterology，2007，133(2):647-658.

[23]Gynecologic Oncology Group，Secord AA，Lee PS，et al.Maspin expression in epithelial ovarian cancer and associations with poor prognosis:a Gynecologic Oncology Group study[J].Gynecol Oncol，2006，101(3):390-397.

[24]Petrocca F，Visone R，Onelli MR，et al.E2 F1-regulated microRNAs impair TGFbeta-dependent cellcycle arrest and apoptosis in gastric cancer[J].Cancer Cell，2008，13(3):272-286.

[25]Skog J，Würdinger T，van Rijn S，et al.Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers[J].Nat Cell Biol，2008，10(12):1470-1476.

[26]Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol，2008，141(5):672-675.

[27]Hanson EK，Lubenow H，Ballantyne J.Identification of forensically relevant body fluids using a panel of differentially expressed microRNAs[J].Anal Biochem，2009，387(2):303-314.

[28]Wang J，Chen J，Chang P，et al.microRNAs in plasma of pancrestic ductal adencarcinoma patients as novel blood-based biomarkers of disease[J].CancerPev Res(Phila)，2009，2(9):807-813.

[29]Valadi H，Ekstr?m K，Bossios A，et al.Exosomemediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J].Nat Cell Biol，2007，9(6):654-659.

[30]Hunter MP，Ismail N，Zhang X，et al.Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles[J].PLoS ONE，2008，3(11):e3694.

[31]Yuan A，Farber EL，Rapoport AL，Tejada D，et al.Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles[J].PLoS ONE，2009，4(3):e4722.

[32]Brameier M，Wiuf C.Ab initio identification of human micro RNAs based on structure motifs[J].BMC Bioinformatics，2007，8:478，

[33]Arshad S，Mumtaz A，Ahmad F，et al.Mi-DISCOVERER:a bioinformatics tool for the detection of mi-RNA in human genome[J].Bioinformation，2010，5(6):271-6.

[34]Sewer A，Paul N，Landgraf P，et al.Identification of clustered microRNAs using an ab initio prediction method[J].BMC Bioinformatics，2005，6:267.

[35]Mizuguchi Y，Mishima T，Yokomuro S，et al.Sequencing and bioinformatics-based analyses of the microRNA transcriptome in hepatitis B-related hepatocellular carcinoma[J].PLoS One，2011，6(1):e15304.

[36]Ghosh Z，Chakrabarti J，Mallick B.miRNomics-the bioinformatics of micro RNA genes[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，363(1):6-11.

[37]Fiber，F.，＆ Engi-，C.(2007).Adaption of Au Nanoparticles and CdTe Quantum Dots in DNA，15(029624)，791-794.

[38]Chan WC，Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science，1998，281(5385):2016-2018.

[39]Bruchez M，Moronne M，Gin P，et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science，1998，281(5385):2013-2016.