熱水自溶法水解草魚內臟工藝的優化

宋 軍 劉忠義 張平安 戴 晴

胡 潘2 魏歡歡2 楊 洋2

（湘潭大學食品與生物工程系，湖南 湘潭 411105）

草魚是中國淡水養殖魚類中產量最高的魚種，2010年，草魚產量達到422.22萬t［1］。在魚類加工中，產生大量的包括魚頭、魚骨、魚鱗和內臟等下腳料，其中魚內臟的含量最大。怎樣有效利用魚類加工副產物，減輕環境污染，一直是人們積極探討的問題。胡衛強等［2］采用氣質聯用法對草魚內臟魚油脂肪酸組成進行了測定，分析結果表明草魚內臟魚油可用來制備生物柴油，還有人報道過使用稀堿加鉀鹽法或酶法從羅非魚內臟中提取魚油［3，4］，以及酶解羅非魚蛋白制取多肽［5］。Aspmo等［6］報道過用酶解鱈魚內臟得到的水解物作為微生物培養基的成分；Zhou等［7］采用5種商業蛋白酶水解鮑魚內臟，測定了水解物的體外抗氧化性。然而，提取單一的部分有用物質并不能充分利用魚內臟，比較好的方法是同時從魚內臟中獲得多種有用物質，乃至最終全部利用魚內臟，基本消除環境負荷。為了達成上述目的，本試驗旨在以草魚內臟為原料，通過熱水自溶法，運用響應面法優化最優水解條件，同時獲得魚油和具有抗氧化活性的水解物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮草魚內臟：收集于本地菜市場，清洗瀝干，勻漿后，20℃ 冷凍儲藏備用；

牛血清蛋白：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；其他試劑：均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

紫外可見分光光度計：WFZ UV－2802SH型，上海尤尼柯儀器有限公司；

數顯水浴恒溫振蕩器：SHA－C型，常州國華電器有限公司；

高速離心機：LG10－2.4A型，北京醫用離心機廠；

數顯pH計：PHS－3BW型，上海般特儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 魚內臟水解及魚油提取率的測定 冷凍的魚內臟4℃下解凍，稱取100g原料于500mL的錐形瓶中，加入適量的蒸餾水，攪拌均勻，密封置于水浴搖床中恒溫振蕩，轉速為200r／min，一定時間后，趁熱4 000r／min離心10min，吸取上層油脂，水解液抽濾，制成干燥物備用，殘渣待繼續處理。魚油用熱的飽和氯化鈉溶液洗2次，最后一次用熱水洗，分離出上層油，真空干燥得到粗魚油。魚油提取率按式（1）計算。

式中：

Y1—— 魚油提取率，%；

m1—— 提取粗魚油質量，g；

m2—— 原料粗脂肪質量，g。

1.2.2 RSM優化熱水自溶法提油工藝條件 在單因素試驗基礎上，選取水解溫度、水解時間和加水量為自變量，提油率為響應值，采用RSM中的BBD對熱水自溶法提油工藝條件進行優化。利用SAS軟件設計試驗方案，根據該方案進行試驗并測定魚油提取率。單因素試驗設計如下：水解溫度考察試驗設定水解時間60min，加水量60mL，考察溫度為50，55，60，65，70℃5個水平；水解時間考察試驗設定水解溫度60℃，加水量60mL，考察時間為30，45，60，75，90min 5個水平；加水量考察試驗設定水解溫度60℃，時間60min，考察加水量為40，60，80，100，120mL 5個水平。

將剩余殘渣加入適量的蒸餾水勻漿成殘渣液，料水比（m∶V）＝1∶4，然后加入2倍體積的石油醚，40℃萃取1h，離心分離出魚油。

1.2.3 油脂的理化指標測定

（1）酸值：參照GB／T 5530——2005測定；

（2）過氧化值：參照GB／T 5538——2005測定；

（3）碘值：參照GB／T 5532——2008測定。

1.2.4 游離氨基氮測定 采用甲醛電位滴定法［8］。

1.2.5 水解液中多肽得率測定 參照文獻［9］的方法。以牛血清蛋白繪制標準曲線，得到牛血清蛋白濃度X與吸光度Y 之間的回歸方程為Y ＝0.006 76＋0.242 57 X，R2＝0.999 57。

1.2.6 羥自由基清除能力測定 參照文獻［10］的方法，并加以修改。取10mL水解液，加入等體積10%的三氯乙酸，4 000r／min離 心 10min。取 上 清 液 2mL 依 次 加 入9mmol／L水楊酸乙醇溶液2mL、9mmol／L FeSO4溶液2mL，最后加2mL 8.8mmol／L H2O2啟動反應。37℃水浴0.5h后，以5%三氯乙酸為參比，在510nm處測定OD值?？紤]到樣品本身的吸光值，以9mmol／L水楊酸乙醇溶液2mL、9mmol／L FeSO4溶液2mL、上清液2mL和蒸餾水2mL作為樣品的本底吸收值，所有測定值均為3次平均值。清除率按式（2）計算。

式中：

I—— 清除率，%；

A0——空白對照液的吸光度；

AX——加入待測液后的吸光度；

AX0——待測溶液的本底吸收值。

1.2.7 還原能力測定 參照文獻［7］的方法，略有修改。取水解液1.0mL依次加入1.0mL 0.2mol／L磷酸緩沖液（pH 6.6）和1.0mL 1%鐵氰化鉀，置于50 ℃水浴中反應20min后急速冷卻，加入1.0mL 10%三氯乙酸，混合后以4 000r／min離心10min。取上清液2.0mL，加入2.0mL蒸餾水和0.4mL 0.1%氯化鐵，混勻，靜置10min后于700nm測定其吸光值。所有測定值均為3次平均值。

2 結果與分析

2.1 魚內臟熱水自溶水解工藝參數的單因素試驗

內臟勻漿程度、pH值、水解溫度、水解時間以及加水量（或者料水比）等很多因素會影響魚內臟的自溶和水解。內臟勻漿能充分破壞內臟的組織結構，有利于內臟的自溶過程能盡快順利完成，然而過度勻漿也可能導致內臟勻漿物黏度太大，動力消耗急劇增加。pH值會影響酶的活性，一般來說，應該是非常重要的影響因素。但是，在試驗中發現高的或者低的pH值會導致魚油皂化或者酸值增加，而對魚油提取率的影響并不大，因此草魚內臟自溶水解時采用內臟勻漿液的自然pH值（pH 6.2～6.4）。經過初步篩選后，選擇水解溫度、水解時間以及加水量3個因素做進一步的研究。

2.1.1 水解溫度對提油率的影響 由圖1可知，當水解溫度為50～60℃時，隨著溫度的升高魚油提取率迅速增加，這可能是因為溫度升高加大蛋白質變性以及內源酶對蛋白質的水解，利于原料中油脂的釋放，溫度為60℃魚油提取率達到最大值，隨后魚油提取率隨著溫度升高而降低。而游離氨基氮含量在50～55℃逐漸增加，55℃達到較大值，繼續增加溫度，游離氨基氮含量減小，這可能與草魚內臟內源酶失活有關。由于魚油特別容易氧化，必須盡可能多的將內臟中魚油提取出來，因此以魚油提取率為主要考量，結合水解液中游離氨基氮的變化，選擇60℃為較優的提取溫度。

2.1.2 水解時間對提油率的影響 由圖2可知，隨著水解時間的延長魚油提取率逐漸增加，當水解時間為60min時魚油提取率增加不明顯，水解液中游離氨基氮含量也趨緩。綜合考慮，75min可能為較佳的水解時間。

2.1.3 加水量對提油率的影響 由圖3可知，魚油提取率隨著加水量的增加而增加，加水量為60mL時達到較大值，加水量繼續增加，提取率逐漸降低。綜合考慮，選擇60mL為合適加水量。

圖1 水解溫度對提油率和游離氨基酸的影響Figure 1 Effects of temperature on fish oil extraction and free amino nitrogen

圖2 提取時間對魚油提取和游離氨基氮的影響Figure 2 Effects of extraction time on fish oil extraction and free amino nitrogen

圖3 加水量對魚油提取和游離氨基氮的影響Figure 3 Effects of water addition on fish oil extraction and free amino nitrogen

2.2 水解工藝參數的響應面優化

2.2.1 因素水平的選取及試驗結果 根據Box－Beknhen中心組合試驗設計原理，選取水解溫度、水解時間與加水量3個因素，以提油率為響應值 （Y1）。 因子編碼及各自變量水平見表1，試驗設計及結果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 運用SAS軟件對響應值進行回歸分析，經擬合得到二次多項回歸方程：Y1＝62.903 33 ＋10.522 5 X1＋13.697 5 X2－ 9.572 5 X3－5.461 667 X21－10.915 X1X2＋3.52 X1X3－8.771 66 X22－0.72 X2X3－7.806 667 X23，回歸分析結果見表3。由表3可知，R2＝98.67%，Ra2dj＝96.29%，表明因變量與自變量之間的線性關系良好，模型的P值遠小于0.01，模型顯著，失擬項在α＝0.05水平上不顯著（P＝0.124 3＞0.05），表明各因素值和響應值間的關系可以用此模型函數化，對響應值作用顯著的有 X1、X2、X3、X21、X22、X23、X1X2，對提油率影響的因素依次是水解時間、水解溫度和加水量，即水解時間對提油率影響最明顯。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Analytical factors and levers for RSA

表2 Box－Beknhen中心組合試驗結果Table 2 Experimental designs and results of oil extraction

模型的響應面圖見圖4。由圖4（a）可知，水解時間和溫度的交互作用顯著，圖4結果和表3數據分析結果吻合。由圖4（b）可知，在選定的范圍內保持X1（水解溫度）定值時，隨著X3（加水量）的增加提油率先增大后減少，同樣保持X3為定值時，隨著X1的增加開始階段提油率迅速增加，隨后趨緩。與回歸分析結果相符，水解溫度和加水量的交互作用不顯著。由圖4（c）可知，水解時間和加水量的交互影響不顯著，與統計結果相符。

為進一步驗證最佳點的值，將所得回歸方程分別對各自變量取一階偏導等于零可得一個三元一次方程組：

表3 回歸分析結果Table 3 Results of regression analysis

解之得X1＝0.186，X2＝0.925，X3＝ －0.698

代入變換公式即得水解溫度為59℃，水解時間為74min，加水量為56mL，該提取條件下，由回歸方程預測提油率的理論值為71.60%。在該條件下進行3平行驗證實驗，得到的結果為平均提油率68.34%，標準差±0.89%。驗證值與預測值較為吻合，說明該模型的擬合程度較好。

2.3 魚油的理化性質

魚油的酸值、過氧化值和碘值見表4。因測定殘渣油脂含量較高，故對殘渣石油醚萃取油脂。由表4可知，只需對粗魚油適當精制，魚油理化性質就能達到中國二級粗魚油國家標準。

表4 油脂的理化性質Table 4 Physical and chemical properties of fish oils

2.4 水解物的抗氧化活性測定

測定最優工藝條件下水解液的抗氧化活性，并以未發生熱水自溶水解的勻漿液比較。由表5可知，勻漿液表現出一定的抗氧化活性，這可能與魚類蛋白源中促氧化劑［11］（包括亞鐵血紅素蛋白和磷脂）的存在有關。較之勻漿液，每10mg干物質的水解液羥自由基清除率增加，達到（18.68±1.80）%。

圖4 各因素交互影響的響應面圖Figure 4 Response surface plot on interactive effects of various factors

表5 水解物的抗氧化活性?Table 5 Antioxidant activity of hydrolysate

試驗測定，草魚內臟和水解液粗脂肪含量分別為734.54，14.38mg／g干物質。絕大部分魚油被抽提出來，剩余魚油一部分存在于殘渣的乳狀液、另一部分為與蛋白質結合的油脂，故分離水解液后的剩余殘渣再經過簡單處理，也可以干燥后制作成飼料。

3 結論

利用RSM優化熱水自溶法水解提油條件為水解溫度59℃，水解時間74min，加水量56mL，在該條件下試驗測定值為（68.34±0.89）%，與預測值（71.60%）較吻合。通過熱水自溶，可以從魚內臟中獲取魚油和具有抗氧化活性的水解液，剩余殘渣也可以制作成飼料。

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3 高加龍，郝記明，劉書成，等.羅非魚內臟魚油提取與精煉工藝研究［J］.科技信息，2009（20）：4～6.

4 白洋，孫忠義，楊思華，等.Alcalase酶酶解羅非魚加工下腳料提油工藝研究［J］.食品工業，2010（6）：26～28.

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