豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4-F112株在Marc-145細胞上最佳增殖條件的研究

張明波 李立莉 盧愛國 袁明霞 張明艷 徐世文

（1東北農業大學動物醫學院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒HuN4-F112株在Marc-145細胞上最佳增殖條件的研究

張明波1，2李立莉2盧愛國2袁明霞2張明艷2徐世文1＊

（1東北農業大學動物醫學院，黑龍江哈爾濱 150030；2哈藥集團生物疫苗有限公司，黑龍江哈爾濱 150069）

為了在Marc-145細胞上獲得更高滴度的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）HuN4-F112株，優化了細胞培養條件、病毒接種劑量、收毒時間和病毒液凍融次數等條件。結果證明Marc-145細胞在MEM培養基、新生牛血清含量8%、細胞接毒密度1.5×105個/mL、pH 7.1條件下生長狀態最好；PRRSV HuN4-F112株的最佳接種劑量為3.0×105TCID50/mL，收毒時間為接種后70～72小時，在-18℃凍融3次，PRRSV HuN4-F112株增殖效果最好。該結果為HuN4-F112株PRRSV疫苗的生產提供了依據。

PRRSV；HuN4-F112株；Marc-145細胞；增殖條件

豬繁殖與呼吸綜合征（porcinere productive and respiratory syndrom，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） 引起的，1992年國際獸醫局（OIE）將其正式命名，該病主要臨床特征是引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸困難。OIE將該病列為必須報告的動物疫病[1]。該病在世界范圍內已流行近30年，僅在美國每年因P R R S給養豬業造成的經濟損失就達5.6億～7.6億美元[2,3]。我國于1996年確認存在豬繁殖與呼吸綜合征。2006年，我國出現高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，給養豬業造成巨大的經濟損失[4,5]。目前，該病已成為我國養豬業的第一大疫病。

為預防和控制該病，農業部組織有關單位先后進行了PRRSV滅活疫苗（N V D C-J X A 1株） 和凍干活疫苗（HuN4-F 112株）的研究和試生產。目前，預防此病的主要產品是凍干活疫苗（HuN4-F 112株）[6]，培養 PRRSV常用的細胞為Marc-145細胞系。本研究旨在探索PRRSVHuN4-F 112株在Marc-145細胞上的最佳增殖條件，為PRRSVHuN4-F 112株活疫苗的生產提供培養條件依據，為在合適的生產成本條件下進行規模化疫苗生產提供研究基礎。

1 材料及方法

1.1 毒株及主要材料

毒株HuN4-F 112株由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供，Marc-145細胞購自美國ATCC公司，ME M培養基為美國Gibco公司產品，新生犢牛血清為山東勁牛生物科技有限公司產品，胰酶為美國Gibco公司產品，48孔細胞培養板和細胞培養瓶為Thermo Fisher公司產品。

1.2 儀器設備

倒置顯微鏡為奧林帕斯顯微鏡，無菌操作間和恒溫培養間為新通過G MP驗收的生產車間萬級（局部百級）無菌室及培養室，C O2培養箱為日本三洋公司產品，轉瓶培養機為藍州飛控器械總廠產品。

2 方法

2.1 血清質量檢測及滅活

每一批血清在使用之前先要進行無菌、支原體和牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的檢驗，檢測結果均為陰性才能用于Marc-145細胞培養，每瓶血清使用前于65℃水浴滅活30分鐘。

2.2 細胞的復蘇及傳代培養

自液氮罐中取出安瓶凍結的生產用細胞，立即置于37℃恒溫水浴槽中，輕搖使細胞融化，1500轉/分鐘離心5分鐘，倒去上清加入細胞生長液吹打，無菌吸出細胞懸液加入到T 75細胞培養瓶中，加入細胞生長液，37.5℃培養至形成單層細胞。

棄去培養瓶中的培養液，加入0.25%胰酶2～4mL對細胞進行消化，至細胞接近霧化時迅速棄去胰酶，加入30mL培養液，用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，將懸液分成3瓶，置37.5℃下繼續培養，觀察細胞貼壁生長情況。待細胞長至單層繼續傳代或用于試驗[7]。

2.3 病毒的復壯

取長成單層的Marc-145細胞，棄去營養液，加入稀釋好的病毒液，補加維持液，置于37.5℃下培養；每天觀察細胞病變（C P E），當C P E達到80%時，凍融2次，于-20℃保存。

2.448 孔細胞培養板培養細胞

培養瓶中長成單層的細胞傳代時，按106個/mL細胞濃度以每孔400μL細胞懸液加入到48孔細胞培養板中，然后輕輕振蕩細胞培養板，使細胞分散均勻，置于體積分數為5%的C O2培養箱中于37.5℃培養。

2.5 病毒含量（TCID50） 的測定

將待測定病毒按10倍系列稀釋至10-7，取 10-5、10-6、10-7三個稀釋度各100μL，加入長成單層的48孔Marc-145細胞培養板，同時設未接毒細胞陰性對照和稀釋濃度為10-1的病毒陽性對照。參照R e e d-Mu e n c h法[5]，測定和計算TCID50。

2.6 細胞生長液最佳血清含量測定

分別使用血清含量為2%、5%、8%、10%四個濃度的ME M培養基培養Marc-145細胞，48小時后棄去營養液，接種病毒液1mL于T 75瓶。加入含3%血清含量的ME M培養基，逐日觀察C P E，當C P E達70%～80%時收獲病毒液，于-18℃反復凍融3次，分別測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為細胞生長液最佳血清含量。

2.7 MEM培養基最佳pH測定

將含8%犢牛血清的ME M培養基p H值 調 整 為 6.6、 6.9、 7.0、 7.1、7.2、7.3、7.4、7.6、7.8，分別作為生長液用于培養Marc-145細胞，接毒、收獲和判定標準同前，分別測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為最佳p H[1]。

2.8 最佳細胞接種密度試驗

將消化、分散后的細胞濃度分別調整為約 5.0×104、1.0×105、1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105個 /mL六個濃度，分別取等量（10mL） 置于T 75細胞培養瓶中培養，待細胞長成單層時分別接毒，接毒劑量、收毒和判定標準同前，以確定適合細胞生長與病毒增殖的最佳細胞密度。

2.9 最佳接毒劑量試驗

分別以 1.5×105、2.0×105、2.5×105、3.0×105、4.0×105TCID50/mL五個劑量接種病毒于已長成單層細胞的T 75細胞培養瓶，收毒和判定標準同前，分別測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為最佳接毒劑量。

2.10 病毒凍融次數試驗

收毒后，分別在-18℃條件下凍融1、2、3、4、5、6次，測定病毒TCID50，以其中TCID50最高者為病毒凍融次數的標準。

3 結果

3.1 病毒復壯后病毒滴度

病毒復壯后，其滴度為107.17TCID50/mL。

3.2 細胞生長液最佳血清含量

從表1可以看出，取8%作為ME M培養基中犢牛血清的最佳含量。

3.3 MEM培養基最佳pH值

當p H值為7.0～7.1時，細胞生長狀態正常，接毒后產毒滴度為107.17TCID50/mL。考慮病毒復制后p H值易減小的因素，所以取p H7.1為病毒復制最佳p H值（表2）。

3.4 最佳細胞接毒密度

從表3可見，病毒滴度與細胞接種量無線性關系。細胞密度在1.5×105個 /mL時，其 TCID50最高（107.37TCID50/mL），因此取細胞密度在1.5×105個/mL為最佳細胞接毒密度。

表1 細胞生長液最佳血清含量的測定

3.5 最佳接毒劑量試驗

從表4可以看出，接毒量為3.0×105TCID50/mL時，細胞所產病毒液TCID50較高（107.33TCID50/mL），因此，在生產實踐中取3.0×105TCID50/mL為最佳接毒劑量。

表2 MEM培養基最佳pH值的測定

表3 最佳細胞接毒密度的測定

表4 最佳接毒劑量的測定

表5 最佳凍融次數的測定

表6 最佳收毒時間的測定

3.6 最佳凍融次數試驗

當凍融次數為3次時，病毒TCID50最高（107.17TCID50/mL）。因此取凍融3次作為最佳凍融次數（表5）。

3.7 最佳收毒時間試驗

在70～72小時，鏡下觀察C P E基本達到80%～85%，經檢測此時病毒TCID50為107.17/mL，達到最高值，因此取病毒感染細胞后70～72小時作為最佳收毒時間（表6）。

4 轉瓶培養

按以上所有最佳條件在10L轉瓶中用1L液體繼續培養，獲取最佳病毒滴度為107.5TCID50，說明轉瓶培養相比較靜止培養，能夠更好地促進病毒充分獲取營養及提高病毒在細胞機體內的復制機能。

5 討論

Marc-145細胞作為PRRSV HuN4-F 112株復制的載體，其生長形態、健康狀況、培養液的各項理化指標對病毒的增殖有較大影響，甚至連收毒時間、凍融次數等也可以成為影響病毒滴度的關鍵因素。但值得注意的是，當用于接種的病毒效價越高，需接種的病毒量、接毒時間、細胞密度等因素都會隨之改變，所以穩定的種毒也是疫苗規模化生產中的關鍵因素。

[1]朱文革,賀云霞,周振成,等.PRRSV N V D C-J X A 1株在Marc-145細胞上增殖條件的優化.動物醫學進展,2010,31(6):66-69.

[2]張建新,王旭田,司獻軍.高致病性豬藍耳病及其防控.中國動物保健，2007(7):17-19.

[3]鄧富江.大力發展生豬養殖 滿足人民肉食需求.肉類工業,2008,324(4):1-2.

[4]張銀田.我國高致病性豬藍耳病疫情及防控情況.獸醫導刊,2007,119(7):12-14.

[5]藍海楠,張輝,崔煥忠,等.Marc-145細胞培養條件摸索及其初步應用.中國畜牧獸醫,2011,38(5):220-223.

[6]湯景元,姜平,蔣文明,等.表達PRRSVM蛋白重組腺病毒的構建及其免疫特性的研究.中國病毒學,2005,20(6):618-622.

[7]R.I.弗雷謝尼（英）.動物細胞培養基本技術指南 (第五版).章靜波,徐存拴等譯.北京：科學出版社,2012.

S858.28

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1673-4645（2013）07-0038-03

2013-05-29

張明波，男，黑龍江人，碩士生，研究方向：動物醫學

徐世文，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：臨床獸醫學