糖尿病合并冠心病患者血紅素氧化酶-1基因多態(tài)性的表達(dá)及其意義

羅順祥 徐尚華 張 虹 鐘文亮 吳艷晴

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院心內(nèi)科一區(qū)，福建南平 353000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院骨科一區(qū)，福建南平 353000

糖尿病血管病變是嚴(yán)重影響糖尿病患者生命質(zhì)量及致死、致殘的主要原因。但臨床上發(fā)現(xiàn)糖尿病患者冠心病的發(fā)生與血糖水平并不相關(guān)，英國(guó)前瞻性糖尿病研究（UKPDS）亦證明單純血糖控制并不能達(dá)到減少糖尿病大血管合并癥的目的。高血糖引起的氧化應(yīng)激是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的主要原因，抗氧化可延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。血紅素氧化酶-1（HO-1）是細(xì)胞保護(hù)蛋白，它分解血紅素產(chǎn)生的一氧化碳（CO）、游離鐵和膽紅素，具有抗氧化、抗炎作用，可保護(hù)血管免受氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)的損傷[1]。HO-1 基因啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)包含著一個(gè)由GT 二核苷酸重復(fù)組成的（GT）n 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）多態(tài)性，人 HO-1 基因啟動(dòng)區(qū)所特有微衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的 （GT）n 長(zhǎng)度直接影響HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，HO-1 啟動(dòng)子區(qū)GT 短重復(fù)序列人體內(nèi)的HO-1 表達(dá)水平更高[2]。本課題探討2型糖尿病（T2DM）患者HO-1 基因多態(tài)性、單核細(xì)胞中HO-1 的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)HO-1 基因多態(tài)性及HO-1 表達(dá)水平與冠心病的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究如何調(diào)節(jié)HO-1 的表達(dá)，從而應(yīng)用于臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2008年6月～2011年10月，選擇在福建醫(yī)科大學(xué)附屬南平市第一醫(yī)院住院經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)合并有冠心病的糖尿病患者62例作為冠心病組，其中，急性心肌梗死2例，陳舊性心肌梗死5例，不穩(wěn)定型心絞痛20例，穩(wěn)定型心絞痛35例；另選擇性別、年齡與冠心病組相仿，經(jīng)冠脈造影證實(shí)無(wú)冠脈明顯狹窄的單純糖尿病患者59例作為對(duì)照組。其中，冠心病組62例，男35例，女27例，平均年齡（62.0±3.2）歲，合并高血壓 30例、吸煙 17例；對(duì)照組 59例，男 31例，女28例，平均年齡（63.0±2.9）歲，合并高血壓36例、吸煙18例。兩組年齡、性別、吸煙、體重指數(shù)（BMI）、血壓、空腹血糖（FPG）、餐后 2 h 時(shí)血糖（2 h PG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 體檢和生化檢查 所有患者入院后測(cè)量身高、體重、腰圍、臀圍和血壓，計(jì)算BMI。禁食10 h 后采空腹靜脈血，測(cè)定血常規(guī)、TC、LDL-C、FPG、HbA1c及 2 h PG。

1.2.2 冠狀動(dòng)脈造影檢查 利用飛利浦公司DSA，采用經(jīng)橈動(dòng)脈或股動(dòng)脈穿刺法進(jìn)行冠狀動(dòng)脈造影，對(duì)每支血管進(jìn)行最佳的多體位造影，以直徑狹窄百分?jǐn)?shù)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。有一條主要冠狀動(dòng)脈直徑狹窄百分?jǐn)?shù)>50%診斷為冠心病，冠狀動(dòng)脈直徑狹窄百分?jǐn)?shù)<20%為正常。

表1 冠心病組和對(duì)照組基本資料比較（±s）

表1 冠心病組和對(duì)照組基本資料比較（±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa

組別例數(shù) 性別（男/女，例）年齡（歲）吸煙[n（%）]體重指數(shù)（kg/m2）收縮壓（mm Hg）舒張壓（mm Hg）空腹血糖（mmoL/L）餐后2 h 血糖（mmoL/L）糖化血紅蛋白（%）總膽固醇（mmoL/L）低密度脂蛋白膽固醇（mmoL/L）冠心病組對(duì)照組62 59 35/27 31/28 62.0±3.2 64.0±2.9 17（27.4）18（30.5）24.6±3.7 23.7±3.5 138.5±24.5 132.8±23.1 81.6±18.4 82.3±16.5 6.7±1.3 7.1±1.0 10.4±1.8 9.8±1.6 6.7±1.6 7.0±1.4 5.20±1.04 4.95±0.73 3.56±0.49 3.29±0.57

1.2.3 HO-1 啟動(dòng)子區(qū) （GT）n 檢測(cè)及分型 采用熒光標(biāo)記PCR 以及毛細(xì)管電泳相結(jié)合技術(shù)進(jìn)行基因分型。取研究對(duì)象外周抗凝血5 mL，分離淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。分離單個(gè)核細(xì)胞后，采用QIAGEN 試劑盒提取細(xì)胞基因組DNA。primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增啟動(dòng)子區(qū)引物。引物序列如下：正向 ：5'-GGATTCCAGCAGGTGACATT-3'；反 向 ：5'-ACAGCTGATGCCCACTT TCT-3'。25 ML 體系PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，循環(huán) 35次，最后 72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物純化后采用ABI 公司3730 進(jìn)行毛細(xì)管電泳，run 3730 data collection v2.0 收集毛細(xì)管電泳熒光信號(hào)，GeneMapper Software v3.5軟件對(duì)峰圖進(jìn)行分型（重復(fù)次數(shù)），確定（GT）n多態(tài)性的多態(tài)。（GT）重復(fù)次數(shù)＜27，為 S 等位基因，（GT）重復(fù)次數(shù)≥27，為 L 等位基因，分別構(gòu)成 SS、SL、LL 這3種基因型[3]。

1.2.4 Western blot 測(cè)HO-1 的表達(dá) 應(yīng)用單去污劑裂解液提取單個(gè)核細(xì)胞蛋白質(zhì)，利用BCA 法測(cè)定蛋白含量，以每孔50 μg 蛋白量加樣，穩(wěn)壓125 V 在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再進(jìn)行蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移槽50 V 轉(zhuǎn)膜1 h）。5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜。將膜分別與一抗、二抗反應(yīng)（HO-1 一抗稀釋度 1∶500，β-actin 一抗稀釋度 1∶1000，二抗稀釋度1∶500，室溫下反應(yīng)2 h）。免疫反應(yīng)后將膜蓋于發(fā)光試劑（北京中杉試劑公司）上反應(yīng)1 min，暗室曝光3～5 min，X線片經(jīng)顯影、定影后待檢。結(jié)果掃描進(jìn)計(jì)算機(jī)，用Image-Pro-Plus 自動(dòng)圖像分析軟件（Version：4.5）對(duì)HO-1 光帶進(jìn)行分析，以HO-1 蛋白帶的灰度峰值代表HO-1 的表達(dá)量[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冠心病組與對(duì)照組（GT）n 重復(fù)序列的多態(tài)分布

在研究人群中，HO-1 基因的啟動(dòng)子區(qū) （GT）n 呈高度多態(tài)性，（GT）n 重復(fù)次數(shù)為14～39次，在所有研究對(duì)象及兩組內(nèi)均呈雙峰分布，23次和30次頻率最高，（GT）n 重復(fù)次數(shù)在各組中的分布頻數(shù)見(jiàn)圖1。按文獻(xiàn)[3]報(bào)道，將HO-1基因的啟動(dòng)子區(qū) （GT）n多態(tài)性分為2個(gè)等位基因：GT 重復(fù)次數(shù)＜27次為短重復(fù)序列（S 等位基因），GT 重復(fù)次數(shù)≥27次為長(zhǎng)重復(fù)序列（L 等位基因）。冠心病組的短重復(fù)序列（S 等位基因）明顯少于對(duì)照組（P＜0.01）。所有患者因此分為攜帶SS、SL、LL 基因型3種。冠心病組HO-1 基因啟動(dòng)子區(qū) （GT）n 重復(fù)序列基因型分布為：SS型15例，SL型16例，LL型31例；對(duì)照組分別為SS型26例，SL型16例，LL型17例，兩組基因型分布存在明顯差異，冠心病組短重復(fù)序列SS型明顯少于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組等位基因及基因型的分布（例）

圖1 （GT）n重復(fù)次數(shù)在兩組的頻數(shù)分布

2.2 Western blot 測(cè)HO-1 蛋白表達(dá)水平

冠心病組患者HO-1 蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，分別為（10.5±1.6）、（15.6±2.2），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。見(jiàn)表3。

表3 兩組血紅素氧化酶-1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

HO-1 是一種誘導(dǎo)性細(xì)胞保護(hù)酶，它分解血紅素產(chǎn)生的CO、游離鐵和膽紅素，具有抗氧化、抗炎作用，可保護(hù)血管免受氧化應(yīng)激及炎癥介質(zhì)的損傷[1]。HO-1 基因啟動(dòng)子內(nèi)存在GT 雙核苷酸重復(fù)序列，其5′端區(qū)域（GT）n 重復(fù)序列具有高度多態(tài)性，（GT）n 重復(fù)次數(shù)對(duì)HO-1 的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用。依照重復(fù)次數(shù)分為S型（n＜27）和L型（n≥27），從而產(chǎn)生 SS、SL、LL 3種基因型。已有的研究發(fā)現(xiàn)HO-1 基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈斑塊負(fù)荷相關(guān)，具有L 基因型的患者較S 基因型的斑塊負(fù)荷明顯加重[5]。而王迎洪等[6]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HO-1 基因多態(tài)性與冠心病冠脈病變程度相關(guān)，LL 基因型頻率分布在多支血管病變組較單支和雙支血管病變組高。但目前對(duì)于上述研究結(jié)果卻存在爭(zhēng)議，在L üblinghoff 等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)HO-1 基因多態(tài)性與冠心病及心肌梗死的發(fā)生并無(wú)相關(guān)性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者冠心病組短重復(fù)序列（S 等位基因）明顯少于對(duì)照組（P＜0.01），冠心病組基因型主要以LL型和SL型為主，對(duì)照組主要以SS型和SL型為主，兩組基因型分布存在明顯差異，冠心病組短重復(fù)序列SS型明顯少于對(duì)照組（P＜0.05）。因此本研究認(rèn)為，在糖尿病人群中，HO-1基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病相關(guān)，相對(duì)于短重復(fù)序列（S 等位基因）者，長(zhǎng)重復(fù)序列（L 等位基因）者為冠心病易感人群。

既往研究表明，短（GT）n 雙核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列（n＜27次）使HO-1 表達(dá)含量上調(diào)，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎癥損傷、抗細(xì)胞凋亡作用，保護(hù)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞[8]。而長(zhǎng)串聯(lián)重復(fù)序列導(dǎo)致HO-1 轉(zhuǎn)錄水平下降，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用減弱[9]。李瑩等[10]的研究證實(shí)在急性冠脈綜合征患者HO-1 表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)，冠脈病變程度越重其HO-1 表達(dá)水平越低。在本研究中，冠心病組與對(duì)照組相比其血壓、血脂、血糖及吸煙等均無(wú)明顯差異，但冠心病組HO-1 表達(dá)水平較對(duì)照明顯降低 [（10.5±1.6）和（15.6±2.2）]（P ＜ 0.01）。進(jìn)一步證實(shí)，在糖尿病人群，擁有長(zhǎng)重復(fù)序列（L 等位基因）患者，其HO-1 表達(dá)水平明顯減低，更易發(fā)生冠心病。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，在糖尿病人群中，HO-1的基因多態(tài)性與冠心病易感相關(guān)，擁有長(zhǎng)重復(fù)序列（L 等位基因）者HO-1 表達(dá)水平較擁有短重復(fù)序列 （S 等位基因）者明顯減低，為冠心病易感人群。基因型分析可以預(yù)示個(gè)體冠心病易感性，但冠心病為因素交互作用所致，須做到早期綜合防治。

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