注射D-半乳糖致大鼠衰老效應(yīng)的評(píng)價(jià)

王 喆 陸承榮 羅 淵 段連寧 顏克松 戰(zhàn)大偉

1.空軍總醫(yī)院臨床航空醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100142；2.解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科，北京 100048

我國(guó)正快速進(jìn)入老齡化社會(huì)，據(jù)第六次全國(guó)人口普查顯示，我國(guó)60歲及以上人口已達(dá)1.78億，占總?cè)丝诘?3.26%。預(yù)計(jì)到21 世紀(jì)中葉，我國(guó)60歲以上老年人將達(dá)到4.8億，占總?cè)丝诘?4%。隨著老齡人口的增加，各種老年疾病也隨之而來(lái)，如何延緩衰老已成為世界各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。因此，研究衰老機(jī)制、建立衰老動(dòng)物模型顯得尤為重要。近年來(lái)，我國(guó)老年學(xué)研究中廣泛將擬自然衰老動(dòng)物模型應(yīng)用于衰老機(jī)制、衰老過(guò)程和抗衰老的研究上，取得了許多研究成果，促進(jìn)了老年生物學(xué)和老年醫(yī)學(xué)的發(fā)展。目前用于衰老研究的動(dòng)物模型有D-半乳糖衰老模型、自然衰老模型、臭氧損傷衰老模型和去胸腺衰老模型等[1]。在衰老研究上以自然衰老動(dòng)物模型最為理想，但由于飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴、動(dòng)物來(lái)源不統(tǒng)一、個(gè)體間差異大，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[2]。雖然D-半乳糖在衰老研究方面應(yīng)用廣泛，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步證實(shí)[3-4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)皮下注射和腹腔注射D-半乳糖在動(dòng)物體內(nèi)導(dǎo)致的自由基代謝、免疫指標(biāo)及病理變化進(jìn)行比較，觀察其擬衰老效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar 大鼠 30 只，體重 250～300 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證為SCXK-（軍）2007-001。動(dòng)物飼養(yǎng)在屏障系統(tǒng)內(nèi)，許可證為SYXK-（軍）2007-008。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器及試劑

紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Beckman 公司；高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；電子天平，上海電子天平儀器廠。D-半乳糖購(gòu)自上海第一制藥廠；氯化鈉注射液購(gòu)自北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司；D-半乳糖與氯化鈉注射液配成5%D-半乳糖-氯化鈉注射液，使用前配制，常規(guī)滅菌后使用；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；甲醛溶液購(gòu)自北京市旭東化工廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

30 只大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型1 組和模型2 組，每組各10 只。參照王亞利等[5]、崔美芝等[6]方法進(jìn)行D-半乳糖衰老模型的建立。模型1 組每天頸部皮下注射D-半乳糖 50mg/（kg·d）；模型 2 組每天腹腔注射 D-半乳糖 500mg/（kg·d）；對(duì)照組每天頸部皮下注射等量（50 mg/kg）生理鹽水。各組大鼠均每天上午給藥，連續(xù)給藥6周。

1.4 體重、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)測(cè)定

每周稱重1次。動(dòng)物處死后迅速取出胸腺及脾，吸去血液，修去脂肪、系膜。用電子天平稱取胸腺、脾濕重，根據(jù)體重計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)。

1.5 胸腺和脾病理組織變化

胸腺和脾分別稱取濕重后，置于10%中性福爾馬林固定液中固定，行常規(guī)脫水，石蠟包埋，組織切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.6 血常規(guī)、SOD 活性和MDA 含量測(cè)定

動(dòng)物處死前眼球采血，測(cè)定血常規(guī)；分離血清，采用化學(xué)比色法測(cè)定SOD 活性和MDA 含量，方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.01 為差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖對(duì)大鼠體重、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響

如表1 所示，與對(duì)照組比較，模型1 組和模型2 組大鼠體重增加比例降低，胸腺明顯萎縮，胸腺指數(shù)明顯減少（P<0.01），而脾指數(shù)增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）；模型1 組和模型2 組間各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 D-半乳糖對(duì)大鼠體重、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s，n＝10）

表1 D-半乳糖對(duì)大鼠體重、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

組別 體重增加比例（%） 胸腺指數(shù)（10 g/kg） 脾指數(shù)（10 g/kg）對(duì)照組模型1 組模型2 組34.06 29.46 28.35 0.11±0.02 0.07±0.03*0.06±0.03*0.20±0.03 0.29±0.03 0.27±0.06

2.2 D-半乳糖對(duì)胸腺和脾病理組織形態(tài)的影響

病理組織觀察顯示，對(duì)照組胸腺淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞密集，染色較深；脾細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。模型1 組胸腺皮質(zhì)明顯變薄、萎縮，細(xì)胞排列稀疏，間隙增大，髓質(zhì)縮小；脾白髓縮小，細(xì)胞減少，紅髓擴(kuò)大并充血。模型2 組胸腺和脾病理變化同模型1 組。說(shuō)明衰老模型大鼠的胸腺萎縮，脾輕度病理改變。

2.3 D-半乳糖對(duì)血常規(guī)的影響

如表2 所示，D-半乳糖對(duì)血常規(guī)無(wú)明顯影響，三組血常規(guī)各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 D-半乳糖對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（±s，n＝10）

表2 D-半乳糖對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（±s，n＝10）

組 別 血紅蛋白（g/L）紅細(xì)胞（×1012/L）白細(xì)胞（×1010/L）中性粒細(xì)胞（%）淋巴細(xì)胞（%）對(duì)照組模型1 組模型2 組147.3±8.3 142.8±9.5 143.2±9.6 8.17±0.45 7.76±0.94 7.83±0.92 13.11±1.92 10.38±2.26 10.64±2.31 0.17±0.01 0.15±0.01 0.16±0.01 0.83±0.02 0.85±0.02 0.84±0.02

2.4 D-半乳糖對(duì)血清SOD 活性和MDA 含量的影響

如表3 所示，與對(duì)照組比較，模型1 組和模型2 組血清SOD 活性顯著下降（P<0.01），說(shuō)明自由基代謝出現(xiàn)異常；血清MDA 含量顯著升高（P<0.01），說(shuō)明D-半乳糖促進(jìn)機(jī)體過(guò)氧化產(chǎn)物形成，使動(dòng)物產(chǎn)生擬衰老效應(yīng)。

表3 D-半乳糖對(duì)大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝10）

表3 D-半乳糖對(duì)大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響（±s，n＝10）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

組別 SOD 活性（NU/mL） MDA 含量（nmol/L）對(duì)照組模型1 組模型2 組132.60±16.48 107.97±21.72*108.15±23.26*3.02±0.48 6.58±0.52*6.65±0.73*

3 討論

建立不同的衰老動(dòng)物模型是常用的揭示衰老機(jī)制和抗衰老研究的實(shí)驗(yàn)工具。衰老的機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未能被充分闡明，而只有研究出生命衰老的機(jī)制，才能采取有效的延衰措施，真正延長(zhǎng)人類的壽命。當(dāng)前有關(guān)衰老機(jī)制的學(xué)說(shuō)多達(dá)300多種，其中公認(rèn)的有免疫學(xué)說(shuō)、自由基學(xué)說(shuō)等[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在為免疫衰老和自由基衰老研究方面提供更加完善的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。隨年齡增長(zhǎng)免疫功能出現(xiàn)逐步減退的過(guò)程稱為免疫衰老。胸腺作為中樞免疫器官，其功能和狀態(tài)直接影響機(jī)體的免疫功能，胸腺的增齡性退化是免疫衰老的直接原因[8]。D-半乳糖衰老模型在機(jī)體免疫器官的研究中主要涉及胸腺、脾、淋巴結(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，衰老大鼠胸腺明顯萎縮，胸腺指數(shù)明顯低于對(duì)照組，脾指數(shù)增高，這與王少康等[9]報(bào)道的結(jié)果一致。同時(shí)病理組織觀察胸腺皮質(zhì)明顯變薄、萎縮，細(xì)胞排列稀疏，間隙增大，髓質(zhì)縮小，提示D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠免疫器官的衰老是引起機(jī)體衰老的重要因素。自由基又稱游離基，是具有一個(gè)以上的未配對(duì)電子的原子或原子團(tuán)、分子或離子。正常情況下體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除保持相對(duì)平衡狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)自由基的清除主要是抗氧化作用，如SOD 可以清除氧自由基，并有隨增齡而減低的趨勢(shì)；自由基的產(chǎn)生可使細(xì)胞中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的MDA 能與蛋白質(zhì)結(jié)合，使之發(fā)生交聯(lián)而喪失功能，并形成脂褐素，可以引起機(jī)體的衰老與死亡[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，D-半乳糖致大鼠的血清SOD 活性下降，MDA 水平升高，說(shuō)明D-半乳糖進(jìn)入體內(nèi)引起的氧自由基代謝失衡是誘發(fā)衰老的主要原因。

選用D-半乳糖來(lái)建立衰老動(dòng)物模型常用大鼠和小鼠，由于雄性動(dòng)物的反應(yīng)較雌性動(dòng)物反應(yīng)敏感，大多選擇雄性動(dòng)物，以Wistar 大鼠、SD 大鼠、昆明小鼠和ICR 小鼠最常見(jiàn)，沒(méi)有種屬、月齡和體重的區(qū)別。一般采用頸背部皮下注射和腹腔注射兩種方法，此外，還有口服給藥途徑。李春海等[11]給大、小鼠口服 D-半乳糖 700 mg/（kg·d） 連續(xù)6周，可造成較好衰老的效應(yīng)，與皮下注射 70 mg/（kg·d）連續(xù)6周造成的衰老效應(yīng)相似，但某些生化指標(biāo)檢測(cè)不及皮下注射給藥途徑顯著。有關(guān)D-半乳糖誘導(dǎo)劑量和造模時(shí)間目前尚無(wú)統(tǒng)一規(guī)定。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，劑量范圍在50～500 mg/（kg·d）連續(xù) 6～8 周給藥比較合適[12]。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖 50 mg/（kg·d）頸背部皮下注射和 500 mg/（kg·d）腹腔注射連續(xù)6周，試驗(yàn)效果良好，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。同時(shí)在造模過(guò)程中應(yīng)注意給藥時(shí)間應(yīng)準(zhǔn)時(shí)，D-半乳糖溶液需密封保存，防止發(fā)生變質(zhì)，并根據(jù)動(dòng)物體重變化調(diào)整D-半乳糖注射劑量，注射時(shí)采取無(wú)菌操作，避免引起大鼠因感染而死亡。

綜上所述，采用D-半乳糖頸背部皮下注射和腹腔注射兩種方法所致大鼠衰老的效應(yīng)，具有效果相近、檢測(cè)指標(biāo)顯著、簡(jiǎn)便易行、價(jià)格低廉、結(jié)果穩(wěn)定的特點(diǎn)。

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