酶法修飾抑制小麥淀粉回生工藝優化及機理探討

熊 柳 南 沖 孫慶杰 李凡飛

(青島農業大學食品科學與工程學院，青島 266109)

新制作面包、饅頭、蛋糕等面制品都具有內部組織結構松軟、有彈性、口感良好的特點;但隨著貯存時間的延長，就會由軟變硬，組織變得松散、粗糙、彈性和風味也隨之消失，降低食品的營養價值和感官品質，這就是食品的回生(老化)現象［1］。這些面制品的回生主要是由于其中所含的淀粉回生引起的。淀粉的回生包括直鏈分子螺旋結構的形成及其堆積、支鏈淀粉外支鏈間雙螺旋結構的形成與雙螺旋之間的有序堆積［2］。直鏈淀粉分子長短及直、支鏈的比例與回生速率呈高度相關，可由消除或抑制支鏈淀粉分子結晶的形成來抑制淀粉質食品的回生［3］。目前，抑制淀粉回生的主要方法有基因修飾、酶法修飾、化學修飾、物理修飾［4］。但是基因修飾的方法抑制淀粉回生，所要求的技術和成本都很高，化學修飾易產生毒性和帶來食品安全問題，物理修飾中的添加食品添加劑如海藻糖、親水性膠體、乳化劑、多糖類、低聚糖、食用膠類和變性淀粉等，盡管這些添加劑對淀粉的回生有一定的抑制作用，但效果遠達不到人們所希望的效果;因此，這些方法在食品工業的應用大大受的限制。酶法修飾是指用酶水解淀粉物質，但保持或至少保持淀粉顆粒結構或分子的層次結構。有研究指出生物酶法是一種很好的抑制淀粉回生的方法，通過在饅頭、面包和米粉等的制作過程中添加淀粉酶，可有效延長米面制品的保鮮時間，是一種較具有前途的方法［5］。

Hardeep SG［6］研究認為在面包貯藏后期，支鏈淀粉的凝沉作用是影響面包老化的主要因素。α－淀粉酶能使支鏈淀粉在糊化時側鏈變短，從而降低支鏈淀粉分枝部分相互合并重結晶的機會，從而延緩面包老化。木伍六司［7］通過研究α－，β－和葡萄糖淀粉酶對米飯硬化回生的影響后認為:β－淀粉酶可以顯著抑制米飯的回生硬化。丁文平等［8］在普魯蘭酶和β－淀粉酶對大米支鏈淀粉回生影響的研究中指出，β－淀粉酶能夠通過切短大米支鏈淀粉外側枝健而抑制其回生，且隨著酶解度的增加回生抑制更加明顯。孫慶杰等［9］通過β－淀粉酶對米粉進行抗回生處理后，生產的保鮮米制品1年內不回生。以上研究主要說明了淀粉酶對于淀粉回生具有抑制作用，酶抑制淀粉回生的機理及酶處理后淀粉的化學結構的變化未作深入研究。孫玲玲等［10］對β－淀粉酶抑制糯米支鏈淀粉回生工藝通過響應面法進行了優化，得出β－淀粉酶抑制糯米支鏈淀粉回生時最佳工藝條件為:酶濃度0.111%，溫度59.8℃，時間41.4 min。但國內并未有對β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生工藝優化的研究。

因此，本研究在前人研究基礎上，以小麥淀粉為原料，采用β－淀粉酶對其進行抗回生處理。采用響應面分析法優化β－淀粉酶抗小麥回生工藝條件;并通過測定在最佳工藝條件下處理后的小麥淀粉中還原糖和直鏈淀粉含量及支鏈淀粉平均側鏈長度，初步探討β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生的機理，為今后β－淀粉酶抑制淀粉質食品回生的工業化提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

直鏈淀粉標樣、支鏈淀粉標樣、β－淀粉酶(酶活力1 771.2 U/g):美國Sigma公司;右旋糖苷標準品:瑞典Pharmacia公司;二甲基亞砜、氯化鈣、鹽酸、3，5－二硝基水楊酸、丁醇、氫氧化鈉、無水乙醇、異戊醇、碘、碘化鉀均為分析純。

1.2 試驗設備

101－1型恒溫干燥箱:上海精宏實驗設備有限公司;冰箱:中國海爾集團公司;紅外水分測定儀:北京賽多利斯有限公司;HH－S恒溫水浴鍋:金壇市醫療器械廠;755B型紫外可見分光光度儀:上海精密科學儀器有限公司;LD5－2A型離心機:上海安亭科學儀器廠;旋轉蒸發器:上海亞榮生化儀器廠;質構測定儀(TA－XT.plus):英國 Stable Micro Systems公司;GPC－RI－DAWN EOS十八角度激光散射聯用系統:美國懷雅特公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥淀粉的制備及脫脂

小麥淀粉的制備:以山東萊州市聯合面粉廠提供的小麥粉為材料，根據梁玲等［11］提供的小麥淀粉的方法，實驗室自制。根據國標提供的方法測得自制的小麥淀粉中含蛋白質0.28%、脂肪0.12%、無機鹽 0.32%、水分 12.8%。

小麥淀粉的脫脂［12］:稱取淀粉20 g溶于400 mL DMSO水溶液中，在90℃加熱30 min，再加入2倍量95%乙醇使淀粉分子沉淀，收集沉淀，并在碾缽中碾成粉末，轉移到布氏漏斗中，以無水乙醇洗滌，最后在CaCl2真空干燥器中干燥至恒重。

1.3.2 β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生的處理工藝

稱取一定量的小麥淀粉，加小麥淀粉質量1.2倍的水(pH保持不變)，攪拌均勻，沸水蒸汽中糊化3 min，冷卻到40～50℃后，添加一定量的β－淀粉酶液(以添加同樣量的蒸餾水作對照)，揉勻于一定溫度下恒溫放置一定時間，之后再沸水蒸汽中蒸3 min滅酶，冷卻，做成質量相同、厚度均勻、表面平整的淀粉凝膠樣品。

1.3.3 響應面法優化β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生工藝

結合前人對酶抑制淀粉回生因素的研究及大量的預試驗基礎上，確定了酶作用時間(X1)、酶作用溫度(X2)及酶濃度(X3)3個對β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生效果影響顯著的因素作為試驗因素，淀粉凝膠硬度(Y)為響應值，根據單因素試驗結果確定試驗因素范圍，分析設計三因素三水平試驗。試驗設計因素及水平編碼見表1，數據采用SAS RSREG統計軟件分析。

表1 試驗因素水平及編碼

1.3.4 小麥淀粉凝膠質構的測定

將經酶處理后小麥淀粉凝膠放于冰箱中，4℃保溫48 h之后，采用TA.XT plus物性儀對制得的β－淀粉酶處理后小麥淀粉凝膠質構進行測定，主要參數為:運行模式:Texture Profile Analysis(TPA);試驗前速:1.00 mm/s;試驗速度:1.00 mm/s;返回速度:1.00 mm/s;測試距離:30.00%;感應力:Auto－10.0 g;兩次壓縮時間間隔 5 s;數據采集速率:200 point/s;探頭:P35，探頭高度為30 mm。測試完畢后利用質構儀分析軟件得到硬度。以上試驗重復3次取平均值。

1.3.5 直鏈淀粉與還原糖含量的測定

淀粉凝膠樣品，用無水乙醇脫水后，50℃烘干，粉碎，過100目篩。直鏈淀粉含量的測定采用碘比色法［13］，于620 nm處測得吸光值，根據標準曲線求得試樣中直鏈淀粉含量。還原糖含量的測定采用3，5－二硝基水楊酸比色法［14］，還原糖含量的計算公式:還原糖=(還原糖質量×樣品的稀釋倍數)/樣品總質量×100%。

1.3.6 酶處理前后小麥淀粉中支鏈淀粉平均側鏈長度的測定

將酶處理前后的淀粉樣品用正丁醇－異戊醇法［15］分離純化直鏈淀粉和支鏈淀粉。取酶處理前后支鏈淀粉6 mg于50 mL離心管中，加入0.5 mL 0.1 mol/L pH 5.0的乙酸鈉緩沖液，95℃加熱溶解30 min，冷卻至室溫，加入3 mL普魯蘭酶溶液(0.1 mol/L pH 5.0的醋酸鈉緩沖液，700 IU)，混合均勻后在40℃水浴中震蕩(150 r/min)水解24～30 h，然后再沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心。

采用蒽酮－硫酸法［16］測定總糖，得一個數據Gr(以葡萄糖的量表示);采用Somogyi法［17］測定還原末端的數量，得到一個數據GR(以葡萄糖的量表示)。按下式計算平均聚合度:

1.4 數據處理

采用Box－Behnken中心組合試驗設計，對工藝條件進一步研究，以獲得最佳工藝參數。采用Design Expert統計分析系統對試驗數據進行多元回歸擬合，建立二次響應面回歸模型模型，并對擬合方程作方差分析，P ＜0.05為顯著，P ＜0.01為極顯著。

2 結果與討論

2.1 響應面法優化β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生工藝

2.1.1 響應面試驗設計與結果

根據Box－Benhnken的中心組合試驗設計原則，結合單因素試驗結果，確定各個因素的選取范圍區間，以響應面試驗設計3次試驗小麥淀粉凝膠的硬度(Y)的平均值為響應值，對顯著影響酶抑制小麥淀粉回生效果的酶作用溫度(X1)、酶作用時間(X2)和酶濃度(X3)3因素進行優化試驗，試驗設計及結果見表2。1～12號為析因試驗，13～17號為5個中心試驗，用以估計試驗誤差。

表2 試驗設計及結果

應用Design Expert軟件，對表2中的數據進行多元回歸擬合，建立二次響應面回歸模型模型如下:

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢測，結果見表3。

表3 方差分析表

由表3方差分析及顯著性檢驗結果可知，該模型回歸顯著(P ＜0.000 1)。R2該模型的 R2=0.992 6，說明此模型與實際試驗擬合較好，試驗失擬項小，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。回歸系數顯著性檢驗表明，在所選取的各因素水平范圍內，對影響β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生效果的3因素主次順序依次是酶作用溫度、酶作用時間、酶濃度。回歸方程的各項方差分析結果表明:一次項和二次項都有顯著性因素，因此各試驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系。所以，可以利用該回歸方程確定處理的最佳條件。

2.1.2 響應面分析

利用Design－Expert軟件進行響應面分析，結果如圖1所示，在酶用量一定時，小麥淀粉凝膠硬度受酶作用溫度與酶作用時間交互影響顯著。凝膠硬度隨酶作用溫度的升高，呈先降低后增大的趨勢。這是由于在一定溫度范圍內，隨溫度的升高，酶活增加，抑制小麥淀粉凝膠的回生效果增強，當溫度超過一定值時，酶活降低或部分失活，故影響了酶對小麥淀粉凝膠回生的抑制效果。因此選擇酶作用溫度在56.5℃左右。在酶作用溫度一定時，淀粉凝膠硬度受酶濃度與酶作用時間交互影響顯著。隨酶濃度和酶作用時間的延長，淀粉凝膠硬度降低。隨時間的延長，酶對淀粉凝膠回生的抑制效果趨于完全，隨著時間的繼續延長，抑制回生效果變化不明顯。在酶作用時間一定時，淀粉凝膠硬度受酶濃度與酶作用溫度交互影響顯著。隨酶濃度的增大，淀粉凝膠硬度呈顯著性降低，在濃度就一步增大時，硬度降低趨于平緩。這是由于隨酶濃度的增大，酶解度逐漸增大達最大，之后趨于平緩。

由圖1可知，酶作用溫度對酶抑制小麥淀粉凝膠回生的效果最好，表現為曲線較陡。其次是酶作用時間和酶用量，表現為曲線較為平緩。經軟件分析，優化的酶抑制小麥淀粉凝膠工藝條件為:酶作用溫度56.5 ℃，酶作用時間32.3 min，酶濃度為34.33 U。

圖1 因素相互作用對淀粉凝膠硬度的影響

2.1.3 β－淀粉酶抑制淀粉凝膠回生工藝參數優化結果驗證

在選取的各因素范圍內，根據二次回歸的數學模型分析結果，最佳工藝條件:酶濃度34.33 U，酶作用溫度為56.50℃，酶作用時間32.20 min。預測在此條件下的小麥淀粉凝膠硬度為5 302 g。為了證實預測的結果，用試驗中得到的最佳工藝條件，重復試驗3次，取平均值，得在4℃的冰箱中保溫48 h后小麥淀粉凝膠硬度值為度為(5 342±7.82)g。與在此工藝條件下預測小麥淀粉中硬度值的相對誤差僅0.75%。

未經酶處理的小麥淀粉凝膠硬度為(15 780.14±8.32)g，經β－淀粉酶處理后，小麥淀粉凝膠硬度降低了66.15%，β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生效果顯著。因此，該試驗所得的數學模型和最佳工藝參數對于工業化應用β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生具有更為準確的指導性，縮短生產周期，降低生產成本，延長淀粉質食品的貨架期。

2.2 酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉及還原糖含量

采用本試驗中優化后的β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生工藝，經碘比色法測得的酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉含量和采用3，5－二硝基水楊酸比色法測得的還原糖含量見表4。

表4 酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉和還原糖含量/g/100 g

從表4可以看出，酶處理后小麥淀粉中還原糖含量顯著性升高，由酶處理前的0.30 g/100 g，增加到8.10 g/100 g。而直鏈淀粉含量顯著性降低，由酶處理前的25.40 g/100 g，減少到21.80 g/100 g。其原因可能是β－淀粉酶從直鏈淀粉的非還原性末端以麥芽糖為單位被分解，造成生成麥芽糖的含量迅速升高。直鏈淀粉由于被部分水解，使得分子長度減小，與碘反應的顏色變淡，使側得的直鏈淀粉含量降低。

大米淀粉的回生主要是由支鏈淀粉的重結晶引起，直鏈淀粉的含量與支鏈淀粉重結晶成核速率有顯著正相關，但與支鏈淀粉最終重結晶程度沒有顯著相關;因此，可以推斷直鏈淀粉通過參與支鏈淀粉晶核的形成來影響支鏈淀粉的重結晶過程，但不參與支鏈淀粉后期晶體的生長和穩定［12，18］。Gidley［19］研究認為直鏈淀粉分子間通過氫鍵形成雙螺旋，在直鏈淀粉雙螺旋富集區中氫鍵堆積形成結晶。Yu等［20］在研究中發現淀粉的回生焓隨直鏈淀粉的含量增加而升高，回生焓值越高回生速率越快。

CGBiliaderis［7］以DSC法系統研究了各種糖類(多羥基化合物)對蠟性玉米淀粉結晶度的影響，研究指出，麥芽糖能有效的抑制淀粉的回生。本試驗中，由于β－淀粉酶的對小麥淀粉的水解作用，縮短直鏈淀粉及支鏈淀粉直線分支的長度，減少其重結晶趨勢，有效的抑制了淀粉的回生，且在同時產生的小分子糖亦有可能起到了抑制淀粉回生的作用。

2.3 小麥淀粉中支鏈淀粉平均側鏈長度

測得的酶處理前后小麥淀粉中支鏈淀粉平均側鏈長度見表5。

表5 酶處理前后支鏈淀粉平均側鏈長度

由表5可知，小麥淀粉經β－淀粉酶處理后，支鏈淀粉平均側鏈長度降低，支鏈淀粉側鏈聚合度顯著降低。Fredriksson等［21］在對直鏈淀粉與支鏈淀粉特性對淀粉回生影響的研究指出，淀粉的長期回生主要是由支鏈淀粉外側短鏈的重結晶所引起，該過程是一個緩慢長期的過程。支鏈淀粉的結晶主要是通過支鏈淀粉外層短鏈以雙螺旋為基質，通過氫鍵堆積而成。姚遠［12］通過高效排阻色譜證實β－淀粉酶的處理可以使部分支鏈淀粉外側短鏈聚合度降低2～3個葡萄糖單位。部分支鏈淀粉外側短鏈聚合度降低，淀粉分子的成核和結晶速度降低，回生受到抑制。同時，有研究指出，β－淀粉酶可以抑制淀粉回生，主要是其能縮短支鏈淀粉的外鏈長度。因此，支鏈的長短與分布對支鏈淀粉的重結晶有重要影響［22］。與前人相關研究結果一致，本試驗中結果顯示，酶處理后樣品中支鏈淀粉平均側鏈分子長度降低，抑制了小麥淀粉的回生，從而使得酶處理后小麥淀粉凝膠硬度相比未經酶處理的小麥淀粉凝膠硬度顯著降低。

3 結論

利用響應面分析法對β－淀粉酶抑制小麥淀粉回生工藝進行了優化。建立了相應的數學模型為以后的中試以及工業化生產提供理論基礎，并且得到了酶處理的最佳工藝條件為:酶濃度34.33 U，酶作用溫度為56.5℃，酶作用時間32.2 min，在此條件下測得小麥淀粉凝膠硬度相對于未經酶處理的小麥淀粉凝膠硬度降低了66.15%。測定酶處理前后小麥淀粉中直鏈淀粉和還原糖含量以及支鏈淀粉平均側鏈長度，發現經β－淀粉酶處理后小麥淀粉中直鏈淀粉含量顯著性降低，由酶處理前的25.40 g/100 g，減少到21.80 g/100 g;還原糖含量顯著性升高，由酶處理前的 0.30 g/100 g，增加到8.10 g/100 g，直鏈淀粉和支鏈淀粉分子質量和分子長度顯著降低，支鏈淀粉側鏈長度降低。因此，得出β－淀粉酶抑制小麥淀粉凝膠回生的主要原因是β－淀粉酶作用小麥淀粉中直鏈淀粉與支鏈淀粉，以麥芽糖為單位水解直鏈淀粉和支鏈淀粉，從而降低了淀粉分子鏈長，降低了其形成雙螺旋的趨向，抑制了淀粉的回生。酶作用過程中產生的麥芽糖也可能對于小麥淀粉凝膠回生亦可能起到了一定的作用。

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