二次正交旋轉組合設計優化水酶法提取獼猴桃籽油的工藝

方 芳 許凱揚 羅忠銀 陳 穎

(長沙理工大學化學與生物工程學院，長沙 410114)

獼猴桃又名楊桃、藤梨、奇異果等，具有很高的營養、醫療、保健、觀賞等開發利用價值，被譽為“水果之王”、“世界珍果”，是目前世界各國競相發展的果品之一［1－3］。近年來，有關獼猴桃果脯、罐頭、飲料等產品紛紛上市，而加工飲料一項就產生了大量獼猴桃籽。獼猴桃籽油中富含多種不飽和脂肪酸、脂類、黃酮類、酚類、維生素等物質，是目前發現亞麻酸含量較高的天然植物油，具有降低血脂、軟化血管和延緩衰老等功效，在醫學、保健和美容等領域具有廣泛的用途，具有極高的開發利用價值［4］。萃取獼猴桃籽油的方法很多，但由于獼猴桃籽油耐熱性能差，采用傳統的熱榨法萃取，油脂中營養成分及活性物質含量較低，不耐貯藏，產品損失較多，收率低，對其色澤產生的影響也較大［5－6］。水酶法是一種新興的提油方法，它是以機械和酶解為手段破壞植物細胞壁，使油脂得以釋放。該技術處理條件溫和，工藝路線簡單(無需脫溶，可直接利用三相離心分離油、水、渣)，而且可以同時萃取油和蛋白質，生產過程能耗相對低，廢水中BOD與COD大為下降，污染少，易于處理［7－10］。試驗以獼猴桃籽為原料，采用水酶法萃取獼猴桃籽油，并對其中的酶解條件進行研究，為獼猴桃籽油的萃取探索一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獼猴桃籽:湖南湘西“米良一號”獼猴桃的種子(主要成分是蛋白質、脂肪和礦物質，含油率31.32%，其中亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸占75%以上)，購于湖南吉首，40℃烘干后用微型植物粉碎機粉碎成粉狀(40目);Alcalase:諾維信公司，最適溫度50～60℃，最適pH 8～10;其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204電子天平:梅特勒－托利多(中國)公司，HH－8電熱恒溫水浴鍋:上海比朗儀器有限公司，TGL18高速離心機:長沙英泰離心機廠，FZ102微型植物粉碎機:上海新諾儀器設備有限公司，101－3電熱恒溫鼓風干燥箱:鄭州南北儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

將洗凈去雜后的獼猴桃籽于恒溫干燥箱中烘干，再經粉碎機粉碎成粉狀(40目)。每次試驗時準確稱取200.0 g于150 mL四頸瓶中，加入一定體積的蒸餾水，混勻、調整pH，然后加入一定量的酶，置恒溫水浴鍋中并用電動攪拌器不斷攪拌，萃取結束后，在電爐上加熱5 min滅酶，在4 000 r/min離心20 min，收集上層游離油，棄去乳狀液及水解液，將殘渣用200 mL蒸餾水洗滌，混勻，4 000 r/min離心10 min，收集上層游離油，將2次離心所得的游離油合并稱重，然后稱量計算出油率。出油率=萃取獼猴桃籽油量÷獼猴桃籽脂肪含量×100%。

1.4 試驗設計與數據處理方法

1.4.1 單因素試驗

準確稱取獼猴桃籽粉末200.0 g，放入150 mL四頸瓶中，在其他條件相同的情況下，采用不同液料比、加酶量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH進行試驗，逐個考察各影響因素對萃取效果的影響。

1.4.2 二次正交旋轉組合設計試驗

在單因素試驗的基礎上，本研究選取的工藝條件范圍是:液料比6～14，酶用量1.5% ～3.5%，酶解溫度40～60℃，酶解pH 8.0～10，選用四因素的二次正交旋轉組合設計表進行試驗，選取因素水平如表1所示。

表1 試驗因素和編碼水平表

1.4.3 數據處理方法

利用統計分析軟件DPS(v3.01專業版)對試驗結果進行分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果與討論

2.1.1 液料比對獼猴桃籽出油率的影響

在酶解溫度50℃，pH 9.0，酶解時間4 h，酶用量為2.5%的條件下，研究不同的液料比對獼猴桃籽出油率的影響，結果見圖1。由圖1可知，隨著液料比的增加，獼猴桃籽的出油率快速上升，在液料比為10時達到最高。這可能是由于酶解時加入的水多有利于蛋白質的溶出，對酶解有利。當液料比大于10時，獼猴桃籽出油率反而有所下降，原因可能是加水量過多降低了酶與底物的濃度，降低了蛋白酶分子與底物分子的碰撞幾率，從而使酶的作用效果下降，油萃取率降低，因此，選擇液料比為10。

圖1 液料比對獼猴桃籽出油率的影響

2.1.2 酶解溫度對獼猴桃籽出油率的影響

在液料比10，酶解pH 9.0，酶解時間4 h，酶用量為2.5%的條件下，研究酶解溫度對獼猴桃籽出油率的影響，結果見圖2。由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，獼猴桃籽出油率不斷上升，且上升趨勢明顯，在50℃時達到最高，出油率為25.46%，但當溫度超過50℃時，隨著溫度升高萃取率迅速下降。這是因為在一定溫度范圍內，溫度的提高增加了分子的動能，促進了擴散作用的進行，酶促反應也服從這個規律。但不同的是，酶是蛋白質，當溫度升高至一定程度時，酶會發生變性，其活性中心的結構被破壞，會部分甚至完全失去其催化活性，從而降低酶解反應速度，根據試驗確定最適宜的酶解溫度為50℃。

圖2 溫度對獼猴桃籽出油率的影響

2.1.3 酶添加量對獼猴桃籽出油率的影響

在料液比10，酶解溫度50℃，酶解時間4 h，pH 9.0的條件下，研究加酶量對獼猴桃籽出油率的影響，結果見圖3。由圖3可知，隨著酶用量的增加，獼猴桃籽出油率不斷升高，這是由于隨著酶濃度的增大，反應速率加快，有利于油脂的釋放，但當酶用量超過2.5%時，出油率增加緩慢，這說明當酶用量超過2.5%時，繼續增加酶濃度對獼猴桃籽出油率貢獻不大。因此，選擇酶添加量為2.5%。

圖3 酶用量對獼猴桃籽出油率的影響

2.1.4 酶解時間對獼猴桃籽出油率的影響

在料液比10，酶解溫度50℃，pH 9.0，酶用量為2.5%的條件下，研究酶解時間對獼猴桃籽出油率的影響，結果見圖4。由圖4可知，隨著酶解時間的延長，獼猴桃籽出油率不斷上升，但當酶解時間超過4 h，出油率增幅很小。這說明酶解反應達到一定時間后，由于底物減少及抑制作用增強等原因，油脂的釋放就不再進一步增加，出油率趨于恒定。因此，選擇酶解時間為4.0 h。

圖4 酶解時間對獼猴桃籽出油率的影響

2.1.5 酶解pH對獼猴桃籽出油率的影響

在料液比10，酶解溫度50℃，酶解時間4 h，酶用量2.5%的條件下，研究酶解pH對獼猴桃籽出油率的影響，結果見圖5。由圖5可知，獼猴桃籽出油率隨著酶解pH的升高而迅速增加，在pH 9.0時達到最高，出油率為25.46%。但當pH超過9.0時，萃取率隨pH的升高而下降，這可能與堿性蛋白酶的最適酶解pH有關，當酶解pH偏離其最適pH時不利于堿性蛋白酶作用，酶活下降嚴重，細胞壁的破壞效果減弱不利于獼猴桃籽油的萃取。

圖5 酶解pH對獼猴桃籽出油率的影響

2.2 水酶法提取工藝優化模型的建立

2.2.1 二次正交旋轉組合設計方案及結果

由DPS(v3.01專業版)統計分析軟件的試驗設計功能可知，四因子二次正交旋轉組合設計包括36個試驗方案，具體試驗方案及試驗結果如表2所示。

表2 試驗設計及結果

根據表2結果，建立獼猴桃籽出油率與液料比X1、酶添加量X2、酶解溫度 X3、酶解 pH X4四因子的數學回歸模型為:Y=26.184 17－0.223 33X1－

試驗結果方差分析見表3。由方差分析可知:回歸方程的失擬性檢驗 F1=2.089 ＜(10，11)=2.94，差異不顯著，說明所選用的二次回歸模型是適當的;回歸方程的顯著性檢驗 F2=15.451＞(14，21)=3.49，極顯著，說明模型的預測值與實際值非常吻合，模型成立。對回歸系數顯著性檢驗，在a=0.10顯著水平剔除不顯著項，得到優化后的方程為:

表3 試驗結果方差分析表

2.2.2 各因素的影響強弱分析

各因素的F值可以反映出各個因素對試驗指標的重要性，F值越大，表明該因素對試驗指標的影響越大，即重要性越大。從方差分析結果可知，各因素對獼猴桃籽出油率的影響強弱順序為:液料比＞酶解pH＞酶添加量＞酶解溫度。

2.2.3 雙因素交互作用分析

由方差分析可知，X1、X2、X43個因素之間存在交互作用，分析結果見圖6～圖8。由圖6～圖8可知，隨著液料比(X1)和酶添加量(X2)的增加，出油率呈上升趨勢，達到一定程度時，出油率達到最大;但當液料比和酶添加量繼續增加時，出油率開始下降。液料比(X1)與酶解pH(X4)具有正相關的協同作用，交互作用可獲得更高的出油率，但當二者增大到一定值時，出油率增加不明顯。酶添加量(X2)與酶解pH(X4)的交互作用表明，二者水平介于－2和0水平之間時，出油率隨水平的增加而明顯增加;當二者水平在0水平以上時，出油率隨水平的增加而下降，這可能與堿性蛋白酶的最適酶解pH有關，當酶解pH偏離其最適pH時不利于堿性蛋白酶作用，酶活下降嚴重，細胞壁的破壞效果減弱不利于獼猴桃籽油的萃取。

2.2.4 提取工藝參數的優化及驗證

采用頻率分析法尋找最優萃取條件，其中出油率高于24.13%的方案有79個，頻率分析結果見表4。由表4可知，在95%的置信區間內出油率高于24.13%的平均值優化萃取方案為:液料比10，酶添加量2.5%，酶解溫度50℃，酶解pH 9.0。在此條件下進行驗證試驗，測得獼猴桃籽出油率為25.46%，與理論值(26.18%)接近，其相對誤差為2.75%，驗證了回歸模型的適合性。

本試驗用獼猴桃籽含油量為31.32%，在優化條件下，一次提取獼猴桃籽的出油率為25.46%，萃取率為81.30%;浸提2次獼猴桃籽出油率為27.17%，萃取率達86.75%。

表4 優化提取方案中Xi取值頻率分布表

3 結論

3.1 通過二次正交旋轉組合設計和二次多項式回歸統計分析，得到水酶法提取獼猴桃籽油的4個主要影響因素液料比、加酶量、酶解溫度、酶解pH與出油率之間的優化數學模型為:Y=26.184 17－，此模型在本試驗范圍內能較準確地預測獼猴桃籽的出油率。

3.2 通過方差分析可知，在本試驗范圍內，各因素對獼猴桃籽出油率影響強弱順序依次為:液料比＞酶解pH＞酶添加量＞酶解溫度。

3.3 采用頻率分析法得到水酶法提取獼猴桃籽油的最優工藝條件為:液料比為10，酶添加量2.5%，酶解溫度50℃，酶解pH 9.0，酶解時間4h，提取2次。在此條件下，獼猴桃籽的出油率為27.17%，萃取率達 86.75%。

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