鐵離子螯合親和層析分離抗氧化活性核桃肽

呂 瑩 劉 靜 陳湘寧

(農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206)

核桃是我國重要的林產(chǎn)品，目前核桃除鮮食外，深加工主要集中在生產(chǎn)核桃乳或核桃油。核桃榨油后剩下的核桃粕中含有大量的核桃蛋白，約占核桃粕重量的50%左右，有研究表明，從核桃粕中提取核桃蛋白進(jìn)行體外酶解后得到的核桃肽具有抗氧化活性［1］。

體內(nèi)金屬離子如銅和鐵離子均含有未配對電子，是產(chǎn)生自由基的重要來源。因此，食物成分若能結(jié)合體內(nèi)的銅和鐵離子，阻斷自由基的產(chǎn)生，即能有效地抗氧化。近年來的研究表明，蛋白質(zhì)及其體外酶解得到的肽段均具有金屬離子螯合能力，如牛奶來源的酪蛋白磷酸肽、雞蛋黃磷酸肽、大豆肽和肉類因子(meat factor)等［2－7］，其肽段氨基酸側(cè)鏈中富含的羧基或磷酸基團(tuán)上的氧、精氨酸或組氨酸的氨基能提供電子對與金屬離子螯合。核桃蛋白中谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸的含量較高，分別為20.19%、10%和13.22%［8］，具有與金屬離子螯合的可能性。但目前有關(guān)核桃肽抗氧化活性的研究多集中在核桃蛋白酶解條件優(yōu)化、酶解工藝的確定上，而有關(guān)核桃肽的金屬離子螯合能力與其抗氧化活性的相關(guān)性鮮見報(bào)道。

金屬離子螯合親合層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)是一種有效的分離具有金屬離子螯合能力的蛋白質(zhì)或肽的手段［9－10］。可以將金屬離子螯合能力不同的肽段分開，廣泛用于肽段的分離。Lund等［11］采用該技術(shù)從奶酪中鑒定了不同的磷酸絲氨酸含量的水溶性磷酸肽。Storcksdieck等［6］也采用該技術(shù)分離了肌肉組織中低分子質(zhì)量的鐵結(jié)合肽。因此，本研究采用鐵離子螯合親和層析技術(shù)分離具有不同鐵結(jié)合能力的核桃肽，考察其抗氧化活性，解析核桃肽的鐵結(jié)合能力和抗氧化活性之間的關(guān)系，為明確核桃肽的抗氧化機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，也為核桃深加工技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫脫脂核桃粕:河北省石家莊京丸有限公司;中性蛋白酶:北京諾維信生物技術(shù)有限公司;IDASephorose－6B:北京本元正陽基因技術(shù)股份有限公司;其他化學(xué)品均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

PP－25 pH計(jì):德國賽多利斯;FD－1C－50冷凍干燥機(jī):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LXJ－ⅡB離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;UV－1800紫外－可見分光光度計(jì):日本島津公司;SHJ－A水浴鍋:安壇市華鋒儀器有限公司。

1.3 樣品制備

低溫脫脂核桃粕溶于水，用5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至 pH 8.0，室溫提取 1.5 h，料液比為 10:1。提取后離心(3 000×g，20 min)。上清液用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)至 pH4.5，室溫靜置 0.5 h，離心(3 000 × g，20 min)。沉淀用水洗2遍后用蒸餾水溶解并調(diào)至pH7.0。中性蛋白酶添加到核桃蛋白溶液中(蛋白質(zhì)含量為20 g/L;酶∶底物 =5∶100)，50 ℃酶解60 min。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶5 min。冷卻到室溫，離心(3 000×g，20 min)收集上清液即為核桃肽溶液，真空冷凍干燥得到凍干粉備用。

1.4 金屬離子螯合親和層析

IDA －Sepharose 6B(25 mL)裝在直徑2.6 cm、長度10 cm的柱中，加入40 mL 0.2 mol/L FeCl3螯合鐵離子30 min(鐵螯合量為(93.5±2.2)μmol/mL濕膠，(467.6±3.6)μmol/g干膠)。柱子經(jīng)過8～9倍床體積的去離子水清洗，以除去不結(jié)合在介質(zhì)上的鐵離子。再用0.05 mol/L pH 4.0的醋酸－醋酸鈉(NaAC－HAC)緩沖液洗柱子5～6倍床體積，除去非特異性結(jié)合的鐵。柱子用不同的平衡緩沖液平衡。核桃肽凍干粉20 mg溶解在1 mL平衡緩沖溶液，上樣，靜止30 min使樣品充分結(jié)合在親和層析介質(zhì)上。采用平衡緩沖液洗脫，并將這部分收集的液體命名為未吸附的組分。結(jié)合到鐵柱上的核桃肽分別采用不同的洗脫劑洗脫，收集洗脫液。洗脫過程流速為1 mL/min，每5 min收集1管，并在220 nm下測定其吸光值，溫度為室溫。

柱子的再生:5～10倍柱床體積的0.05 mol/L的EDTA洗柱，后用純凈水流洗5～10個柱床體積，流速為1 mL/min。

1.5 不同pH平衡緩沖液對核桃肽吸附能力的影響

核桃肽吸附試驗(yàn)所用的緩沖液:(A)緩沖液為0.05 mol/L 的 NaAC － HAC、pH 5.5;(B)0.05 mol/L的2－嗎啉乙磺酸［(2－(4－Morpholino)ethanesulfonic acid，MES)］，用 NaOH 調(diào)整到 pH 6.0;(C)0.05 mol/L 的 Tris－ HCl、pH 7.5。

1.6 不同洗脫劑對吸附到親和層析柱上核桃肽洗脫效果的影響

使用的洗脫緩沖液為:(D)0.02 mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4);(E)0.02 mol/L磷酸二氫鈉(NaH2PO4);(F)0.02 mol/L 的咪唑;(G)0.02 mol/L的谷氨酸鈉;(H)0.02 mol/L的丙二酸。

1.7 核桃肽抗氧化活性的測定

1.7.1 總還原能力的測定

核桃肽樣品液2 mL，加入2 moL/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液混合，再加入2 mL 1%的鐵氰化鉀充分混合。混合物在50℃下加熱20 min。再加入2 mL 10%的TCA，混合。混合物離心(3 000×g，10 min)。取上層清液2 mL加入2 ml蒸餾水和0.4 mL、0.1%的FeCl3，三者充分混合。反應(yīng)10 min后，于700 nm下測定吸光值。以蒸餾水作為對照，核桃肽的還原能力以U(樣品的吸光值－對照的吸光值)表示［12］。

1.7.2 2，2－聯(lián)氮 －二(3－乙基 －苯并噻唑 －6－磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除活性

將ABTS溶液配制成終濃度為7 mmol/L的溶液，加入2.45 nmol/L的過硫酸鹽混合，混合液在室溫暗處放置12～16 h。反應(yīng)前，將ABTS溶液用0.2 mol/L、pH 7.4的磷酸鈉緩沖液稀釋，使其在734 nm處的吸光值為 0.7～0.02。在 40μL的樣本液(1 mg/mL)中加入4 mL ABTS稀釋液，漩渦振蕩器混合30 s，于暗處放置6 min。在734 nm下測定其吸光值，以蒸餾水為對照。核桃肽清除ABTS自由基的活性以 U(1 －A樣品/A水)表示［13］。

1.8 肽含量的測定

按Lowry等［14］方法分析，肽含量以蛋白含量計(jì)，以牛血清白蛋白(BSA)作標(biāo)準(zhǔn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有的試驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±SD)形式表示，n=3以方差分析ANOVA來檢測平均值之間的差異，以P﹤0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)分析使用OriginPro 7.5軟件包。

2 結(jié)果和討論

2.1 不同pH的平衡緩沖液和洗脫劑對核桃肽在鐵離子親和層析柱上吸附行為的影響

為了明確核桃肽和鐵的相互作用、分離不同鐵結(jié)合能力的肽段，比較了不同pH的平衡緩沖液和洗脫劑對核桃肽在鐵離子親和層析柱上的吸附行為。

平衡緩沖溶液的pH值對核桃肽在鐵親和層析柱上吸附能力的影響如圖1所示。

圖1 不同pH條件下核桃肽在鐵親和層析柱上的吸附行為

圖1中峰1為未吸附到鐵親和層析柱上的核桃肽，而峰2為吸附到親和層析柱上并用洗脫劑洗脫下來的核桃肽組分。當(dāng)用pH 5.5的NaAC－HAC緩沖液平衡柱子時，峰1所占比例很小，大部分的核桃肽吸附到層析柱上。而與pH 5.5的條件相比，當(dāng)平衡緩沖液的pH分別升高到6.5和7.5時，峰1組分逐漸提高，而峰2的量明顯下降。說明隨著pH的增加，未吸附到層析柱上的核桃肽量逐漸增加，吸附的肽組分減少，相應(yīng)的核桃肽與鐵的親和力下降。這一結(jié)果與Zachariou等［15］發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在固定Fe3+的介質(zhì)上的吸附情況具有pH依賴性一致。通常情況下蛋白質(zhì)的谷氨酸、天冬氨酸的羧基、絲氨酸的磷酸基團(tuán)、及組氨酸的氨基參與鐵結(jié)合。核桃蛋白中谷氨酸和天冬氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為15%～20%、絲氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為4%［8，16］。谷氨酸和天冬氨酸的等電點(diǎn)分別為2.77和3.2，在 pH 5.5的條件下，天冬氨酸和谷氨酸的羧基電離與鐵螯合。而當(dāng)pH升高到6.5時，溶液中羥基與羧基競爭結(jié)合鐵，隨著pH上升到7.5，核桃肽在鐵柱上的結(jié)合能力下降。核桃蛋白中組氨酸的含量約為7%［16］，組氨酸的等電點(diǎn)為7.6，在pH 5.5的條件下不會離子化與鐵結(jié)合，因此在該條件下，核桃肽中谷氨酸和天冬氨酸的羧基和絲氨酸的磷酸基團(tuán)可能參與的鐵的結(jié)合，而組氨酸的作用不明顯。

為了有效地分離鐵結(jié)合核桃肽，研究其鐵結(jié)合能力與抗氧化活性之間的關(guān)系，進(jìn)一步對洗脫劑進(jìn)行選擇。圖2顯示了當(dāng)平衡緩沖液固定為pH 5.5的NaAC－HAC緩沖液，采用不同洗脫劑洗脫吸附到鐵親和層析柱上的核桃肽時，肽段的解析行為。其中，采用Na2HPO4洗脫的核桃肽的量要高于NaH2PO4作為洗脫劑的肽量，磷酸二氫鈉又高于咪唑，而谷氨酸鈉幾乎不具有洗脫與鐵柱結(jié)合的核桃肽的能力。

圖2 不同洗脫劑洗脫吸附到鐵親和層析柱上的核桃肽

同樣含有磷酸基團(tuán)，但磷酸氫二鈉的洗脫能力好于磷酸二氫鈉，說明堿性條件跟有利于破壞核桃肽和鐵之間的相互作用;而主要用于分離以組氨酸的氨基與肽段螯合的咪唑從柱上洗脫的核桃肽量較少，這一結(jié)果也說明在同樣的堿性下條件，磷酸基團(tuán)可以減少核桃肽和鐵之間的相互作用，意味著核桃肽和鐵之間的結(jié)合位點(diǎn)可能大部分是羧基，而組氨酸的作用次之。另外，本試驗(yàn)中采用丙二酸作為洗脫劑，但丙二酸將鐵從柱上分離，因此不能用來洗脫樣品。

2.2 鐵離子螯合親和層析分離核桃肽

根據(jù)上述結(jié)果，pH 5.5的NaAC－HAC緩沖液作為平衡緩沖液，0.02 mol/L的磷酸氫二鈉作為洗脫劑進(jìn)行鐵結(jié)合核桃肽的分離。為了獲得更多的鐵結(jié)合能力不同的核桃肽組分，分別采用0.01mol/L和0.02 mol/L的磷酸氫二鈉進(jìn)行階段洗脫，可以得到2個峰。如圖3所示，經(jīng)過分離，得到了不能吸附到鐵柱上的、沒有鐵結(jié)合能力的峰1(F1)，和具有鐵螯合能力，且結(jié)合能力逐漸增強(qiáng)的峰2(F2)和峰3(F3)。金屬離子螯合親和層析技術(shù)廣泛用于金屬離子螯合蛋白質(zhì)和肽段的分離。Lund等［17］采用該技術(shù)從奶酪中鑒定了不同的磷酸絲氨酸含量的水溶性磷酸肽。Storcksdieck等［6］也采用該技術(shù)分離了肌肉組織中低分子量的鐵結(jié)合肽。因此，本研究采用鐵離子親和層析柱分離不同鐵結(jié)合能力的核桃肽組分是可行的。

圖3 鐵親和層析柱分離不同鐵結(jié)合能力的核桃肽

2.3 核桃肽抗氧化活性及其與鐵結(jié)合能力的關(guān)系

收集F1、F2和F3組分，采用Folin－酚法測定3個組分的肽含量，分別為F1:(63.04±0.53)mg/mL;F2:(56.46 ±1.24)mg/mL;F3:(11.21 ±0.01)mg/mL。3種組分的比例大致為6∶5∶1(表1)。采用總還原能力和ABTS自由基清除能力2個方法測定3個峰核桃肽的抗氧化活性，結(jié)果如表1所示。F3的總還原能力為(0.66 ±0.06)U/mg，顯著高于 F1(0.07 ±0.01)U/mg和 F2(0.43 ±0.08)U/mg(P ＜0.05);F3清除 ABTS自由基的能力為(1.41±0.20)U/mg，顯著高于 F1(0.49 ±0.12)U/mg和 F2(1.03 ±0.03)U/mg(P＜0.05)。也即，三個組分的核桃肽，無論是總還原力還是ABTS自由基清除的能力，均為F3＞F2＞F1(P＜0.05)。根據(jù)前面的結(jié)果，這三個峰鐵結(jié)合能力的順序也為F3＞F2＞F1。總結(jié)這兩個結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，鐵結(jié)合能力越強(qiáng)的核桃肽，其還原能力和清除ABTS自由基的能力也越強(qiáng)，抗氧化活性越高。

表1 鐵親和層析柱分離的核桃肽組分的肽含量和抗氧化活性

采用銅離子結(jié)合的親和層析柱考察鷹嘴豆和向日葵蛋白酶解物的抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)，結(jié)合銅離子的肽段具有抗氧化活性［17－18］，進(jìn)一步的分析表明，肽段中富含組氨酸。通過研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白質(zhì)酶解物具有與鐵螯合的能力，且鐵結(jié)合能力越強(qiáng)抗氧化活性越高。機(jī)體內(nèi)的金屬離子如:鐵和銅離子易生成自由基，引起一系列氧化損傷。近年來的研究表明，食物中具有結(jié)合金屬離子的能力的成分如:植酸、酚酸等，能夠阻止自由基的產(chǎn)生，從而起到抗氧化的作用［19－20］。因此，綜合上述研究結(jié)果，核桃蛋白酶解物的抗氧化活性與其結(jié)合金屬離子的能力有關(guān)。

3 結(jié)論

通過研究發(fā)現(xiàn)，核桃肽在酸性條件(pH 5.5)下與鐵的結(jié)合能力最強(qiáng)，隨著pH逐漸升高，結(jié)合能力下降。磷酸氫二鈉對吸附到鐵親和層析柱上核桃肽的洗脫效果最好，通過階段洗脫，可以得到不同鐵結(jié)合能力的核桃肽。對其進(jìn)行抗氧化活性分析發(fā)現(xiàn)鐵結(jié)合能力強(qiáng)的核桃肽抗氧化活性高。因此，本研究通過分析核桃肽和鐵之間的相互作用，確定分離核桃肽的條件，分析了核桃肽的鐵結(jié)合能力和抗氧化活性的關(guān)系，為闡明核桃肽的抗氧化機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

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