棉籽蛋白源ACE抑制肽的制備過程中脫鹽技術的研究

劉 軍 徐志宏 魏振承 廖森泰 穆利霞

(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東省農產品加工重點實驗室，廣州 510610)

棉籽蛋白是一種僅次于大豆蛋白的優質植物蛋白，其營養價值高于禾谷類蛋白，含有小麥、稻米等谷類作物所欠缺的必需氨基酸，除蛋氨酸稍低外，其余氨基酸均達到聯合國糧農組織(FAO)推薦的標準［1］。但是棉籽蛋白的結構緊密，分子質量大，人體攝入后不易消化吸收，因而一直沒有得到充分的利用。棉籽蛋白經水解成肽后，分子質量減小，結構疏松，便于人體內酶的進攻，吸收率大大提高［2］。因此，開發棉籽系列功能性活性肽產品有著重大的現實意義。

棉籽蛋白在酶水解過程中，需要不斷加入堿液來維持反應體系的pH值，導致水解液中殘留了大量的無機鹽，影響了產品的生物活性和性質，也不利于對其進一步的分析，因此有必要對酶解液進行脫鹽純化處理，以提高棉籽多肽的生物活性。目前報道的酶解液脫鹽效果比較好的主要有001×7、201×7型陰陽離子交換樹脂、MWCO100透析袋和DA201－C型大孔吸附樹脂脫鹽。但這幾種脫鹽方法各有優劣，對不同來源的蛋白水解液脫鹽效果也各不相同。本試驗比較了3種具有代表性的脫鹽方法的優劣，研究了棉籽蛋白酶解降壓肽脫鹽方法的最佳工藝，探討脫鹽純化工藝對棉籽蛋白酶解液的ACE抑制活性和氨基酸組成的影響，并對Sephadex G－25葡聚糖凝膠色譜分離純化獲得棉籽肽各組分進行ACE抑制活性測定，確定活性組分的分子質量分布范圍，從而為棉籽蛋白酶解制備ACE抑制活性肽提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

棉籽分離蛋白(CPI):自制，蛋白質量分數90.78%，棉酚含量 17.6 mg/kg;堿性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶、復合風味蛋白酶(Flavourzyme):丹麥諾維信(Novozymes)公司;離子交換樹脂001×7、201×7:廣州金東方樹脂化工有限公司;MWCO100透析袋:北京中西化玻儀器有限公司;DA201－C大孔吸附樹脂:江蘇蘇青水處理工程集團有限公司;血管緊張素轉化酶(ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)、標準品牛血清白蛋白、溶菌酶、VB12和L－酪氨酸:美國sigma公司。

1.2 儀器

SHA－B水浴恒溫振蕩器:常州澳華儀器有限公司;PHS－3C型酸度計:上海雷磁儀器廠;KDN－08A半自動凱氏定氮儀:上海新嘉電子有限公司;LD－5－A型離心機:上海安亭科學儀器廠;UV－1800紫外可見光分光光度計:島津分析儀器;5200電導率儀:上海自動化儀表有限公司;HL－1B數顯恒流泵:上海滬西分析儀器有限公司;SBS100數控計滴自動部份收集器:上海滬西分析儀器有限公司;Agilent 1100系列液相色譜儀:安捷倫液相色譜儀公司。

1.3 測定方法

1.3.1 含氮量的測定:微量凱氏定氮法

1.3.2 含鹽量的測定:莫爾法［3］

以K2CrO4為指示劑，用AgNO3標準溶液進行滴定。由于AgCl沉淀的溶解度小于Ag2CrO4沉淀，因此溶液中首先析出AgCl沉淀，當溶液中的氯化物與AgNO3完全作用后，過量的AgNO3立即與K2CrO4反應生成磚紅色的Ag2CrO4沉淀，指示到達終點。用已知濃度的AgNO3溶液測定Cl－濃度，即可獲得氯化鈉鹽的含量，再按下式計算脫鹽率:

1.3.3 ACE 抑制率測定

參照Cushman等［4］的方法，有所修改。按照表1將各試劑加入到試管中，在37℃水浴中反應30 min，反應結束后馬上加入1 mol/L的HCl以終止反應(樣品c需提前加入HCl);然后于各試管中加入乙酸乙酯 1.5 mL，混合后進行離心(4 000 r/min，10 min)，吸取1 mL乙酸乙酯層于另一試管中，放入烘箱中120℃揮發溶劑35 min，拿出冷卻后加入去離子水3 mL漩渦混合后在228 nm下測定吸光值，計算公式為:

式中:Aa為ACE和ACE抑制劑同時存在的吸光值;Ab為不加抑制劑的吸光值;Ac為ACE與HHL空白反應的吸光值。

1.3.4 氨基酸分析

采用HPLC法，樣品按GB/T 18246—2000酸水解處理，按JY/T 024—1996測定。

1.4 試驗方法

1.4.1 棉籽蛋白水解液的制備流程［5］

稱取一定量的棉籽分離蛋白(經過脫除棉酚處理)，加水配制成懸浮液，調節體系溫度和pH至酶作用最適條件，加堿性蛋白酶和胰蛋白酶復合水解，采用pH－stat裝置控制反應體系的pH值在±0.05之內，并不停的震蕩攪拌，以便水解反應均勻、充分。反應一段時間后再加風味酶繼續水解一定時間，然后加熱滅酶(90℃，10 min)即得酶解液。酶解液離心(4 000 r/min，20 min)后的上清液進行分離純化。

1.4.2 脫鹽方法

本試驗綜合比較了3種方法對棉籽蛋白水解液進行脫鹽:

方法1(陰陽離子交換樹脂脫鹽):將處理過的陰陽離子交換樹脂裝柱，樣品先后通過強酸性陽離子交換樹脂001×7和強堿性陰離子交換樹脂201×7，用去離子水作洗脫劑，通過不同流速收集最后流出液，測定含鹽量和含氮量，計算脫鹽率和氮回收率。

方法2(透析袋脫鹽):將樣品裝入處理過的MWCO100的透析袋中，浸泡在去離子水中于4℃下透析，每4小時換一次水，24、48 h后測定水解液的含鹽量和含氮量，計算脫鹽率的氮回收率。

方法3(大孔樹脂脫鹽):樣品溶液流過DA201－C大孔吸附樹脂層析柱(2.6 cm×30 cm)，控制體積流量，檢測流出液的，以=0.05為透過點。試驗中所用樣品的體積均小于透過點通液量，用去離子水以同樣流速洗柱至流出液的電導率與去離子水一致，再用75%乙醇解吸，通過不同流速收集最后流出液，減壓濃縮蒸去乙醇加去離子水定容測含氮量。計算脫鹽率和氮回收率。

脫鹽率=(水清洗液中Cl－濃度×水洗液體積)/(吸附前樣品溶液中Cl－濃度×上樣體積)×100%

氮回收率=(解吸后N濃度×定容體積)/(吸附前樣品N濃度×上樣體積)×100%

1.4.3 標準洗脫曲線方程的獲得

將己知分子量標準品牛血清白蛋白(M r=6.7×104)、溶菌酶(M r=1.44 × 104)、VB12(M r=1.37 ×103)和L－酪氨酸(M r=181.2)配成一定濃度的溶液，經針式微孔膜過濾后上樣過Sephadex G－25，上樣量為1.0 mL，得標準物質洗脫曲線。然后以分子量的對數為橫坐標、洗脫管數(保留時間)為橫坐標作圖，得標準物質洗脫曲線方程Y=－5.364 4X+64.035(R2=0.998 5)。

2 結果與分析

2.1 離子交換樹脂處理對脫鹽效果的影響

陰陽離子交換樹脂脫鹽主要是根據氨基酸與苯乙烯系強酸性陽離子交換樹脂之間既存在離子間的靜電作用，又存在疏水作用，且二者之間存在協同作用，用水作為洗脫劑，使鹽和氨基酸得到分離［6］。此方法脫水解液中的鹽簡單易行，用水作為洗脫劑既廉價又不造成污染，樹脂再生即可重復使用。在保持室溫的條件下，考察了不同流速對脫鹽效果的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同流速離子交換樹脂的脫鹽效果

由圖1可知，不同的流速脫鹽對氮回收率及脫鹽率都有影響。流速越大，脫鹽率和氮回收率也隨之降低。離子交換樹脂的脫鹽率很高，但氮的回收率太低，不足10%，在實際工業生產中遠遠達不到要求。因此，選用陰陽離子交換樹脂對棉籽蛋白水解液脫鹽處理不合適。

2.2 透析對脫鹽效果的影響

考慮到棉籽蛋白水解液和鹽分之間分子質量存在較大差異，用截留分子質量為100 u的透析袋對水解液精致處理，結果如圖2所示。

圖2 不同透析時間的脫鹽效果

由圖2可知，透析時間與脫鹽率和氮回收率之間存在量效關系。透析48 h后，脫鹽率可達61.40%，此時氮回收率為51.40%。相對來說，透析脫鹽的方法簡單易行，脫鹽效果較好，但操作量小，耗時時間長，僅限于實驗室操作，不適合工業上的大規模生產。

2.3 大孔吸附樹脂處理對脫鹽效果的影響

大孔吸附樹脂脫鹽是根據化合物的疏水基團與樹脂的非極性吸附劑之間的范德華引力和靜電引力來達到分離水溶性化合物。多肽可以從水相中通過疏水作用吸附到樹脂的疏水表面和網絡空穴內部，從而與鹽類分離，再通過合適濃度的乙醇洗脫就可以回收多肽［7］。考察了1.5、3、6 mL/min 3 種流速對脫鹽效果的影響，結果如圖3所示。

圖3 不同流速大孔吸附樹脂的脫鹽效果

由圖3可知，流速不同對氮的回收有很大影響，流速越大，造成的氮損失越多，多肽回收率降低;流速不同對脫鹽率的影響不顯著，而且脫鹽率都在90%以上。在實際的工業生產中要考慮到縮短生產周期和較高的蛋白回收率，選用流速3 mL/min較為合適，其氮的回收率相比流速1.5 mL/min并沒有顯著降低，但周期縮短1倍，更利于工業化大生產，且樹脂的吸附能力沒有降低。

2.4 大孔樹脂脫鹽對棉籽蛋白ACE抑制肽的影響

用脫鹽率、氮回收率和ACE抑制率為指標考察DA201－C大孔吸附樹脂對棉籽蛋白水解液的脫鹽效果，分析結果見表2。

表2 DA201－C樹脂脫鹽前后比較

從表2來看，流速為3 mL/min的脫鹽效果非常明顯，脫鹽率達到94.78%，氮回收率86.32%，而且脫鹽后ACE抑制率顯著提高，半抑制濃度 IC50從0.486 mg/mL 下降到0.328 mg/mL。

2.5 大孔樹脂脫鹽對棉籽蛋白水解液氨基酸組成的影響

對脫鹽前后的棉籽蛋白酶解液進行氨基酸組成分析，結果見表3。從表3可以看出，棉籽蛋白水解液中含有豐富的 Asp，Glu，Arg，Phe，Leu 等必需氨基酸，是一種優質的植物蛋白肽。經過DA201－C大孔吸附樹脂處理后，水解液中的 Tyr，Phe，Ile，Leu，Lys等疏水性氨基酸得到了有效富集，這是因為部分親水性氨基酸未完全被大孔樹脂吸附而流失［8］，而具有吲哚環的Try(未檢測)或苯環的Tyr和Phe可以被樹脂強烈吸附，具有較長脂肪族側鏈的氨基酸Leu、Ile和具有琉基的Met(含量太低)也可被充分吸附［9］，從而使得疏水性氨基酸得到了富集，脫鹽后疏水性氨基酸大幅度增加，其總和所占比例是脫鹽前的近2倍。

ACE抑制活性肽都含有豐富的疏水性氨基酸［10］。棉籽多肽中含有較多的疏水性肽段，因而其具有很好的ACE抑制活性，而且這些疏水型氨基酸能很好地被DA201－C大孔吸附樹脂吸附而得到富集，從而進一步提高了棉籽蛋白水解液的ACE抑制活性。

表3 棉籽蛋白水解液脫鹽前后的氨基酸組成分析/mg/g蛋白質

從表3還可以看出，脫鹽后水解液中Tyr和Phe含量增幅最大，達到2倍以上，這正符合ACE抑制活性肽模型相符［11］，該模型認為疏水性氨基酸殘基占60%以上，且末端的氨基酸種類如果是芳香族氨基酸或疏水性氨基酸殘基，則與血管緊張素轉換酶結合能力強，降壓活性高，這也是棉籽蛋白水解液脫鹽后ACE抑制活性提高的另一個原因。

2.6 Sephadex G－25分離純化ACE抑制肽

凝膠過濾層析技術可分離分子質量大小不同的蛋白質并測定其分子質量。Sephadex G－25分離范圍是1 000～5 000 u，適用于脫鹽、肽與其他小分子的分離。對脫鹽后的棉籽蛋白水解液采用Sephadex G－25分離純化，如圖4所示:共有7個峰出現，前面的3個峰屬于蛋白峰，不予以考慮。將后4個峰依次命名為峰Ⅰ(39～43管)、峰Ⅱ(44～49管)、峰Ⅲ(50～54管)和峰Ⅳ(55～61管)，可以分成4個組分。同時可以看出，棉籽蛋白酶解物分子質量是連續分布的，即水解物中存在著各種大小不等的肽分子，結合標準物質洗脫曲線方程可知大部分棉籽肽分子質量分布在13 000 u以下。

圖4 棉籽蛋白酶解物的凝膠過濾層析洗脫圖

2.7 各組分的ACE抑制活性比較研究

把收集到的各管洗脫液按各組分合并，定量后比較ACE活性的抑制率，結果如圖5。由圖5可知，各組分對ACE的抑制率差異較大。組分Ⅲ的抑制率最高，達到83.63%，其次是組分Ⅱ，為62.75%，最差的是組分Ⅰ和Ⅳ，分別為32.81%和28.52%，結合標準物質洗脫曲線方程粗略發現，組分Ⅲ的分子質量小于1 ku，說明小分子質量的棉籽短肽的ACE抑制活性最高，這與Miguel等［12］的結論是一致的。

圖5 各組分的ACE抑制活性

3 結論

3.1 大孔吸附樹脂對棉籽蛋白水解液脫鹽簡單可行，在流速為3 mL/min時，脫鹽率可達到94.78%，氮回收率為86.32%;比較脫鹽前后的疏水性氨基酸變化，發現脫鹽后疏水性氨基酸(特別是Tyr和Phe)得到有效富集，ACE抑制率顯著提高，半抑制濃度IC50從0.486 mg/mL 下降到 0.328 mg/mL。由于大多數的生理活性肽的生理活性都與其疏水性有關，因而采用DA201－C大孔吸附樹脂吸附脫鹽可望成為一種有效分離純化活性肽的方法。

3.2 DA201－C大孔吸附樹脂脫鹽純化后疏水性氨基酸得到了有效富集，ACE抑制率顯著提高。分離純化后的ACE抑制肽各組分中，組分Ⅲ的抑制率最高，分子質量小于1 000 u的短肽。

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