正交設計法優選懷山藥軟化切制工藝

張華鋒， 李曉坤， 楊 云， 張振凌， 石延榜， 杜紹亮

(河南中醫學院藥學院，河南鄭州450008)

山藥是薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb．的干燥根莖，正宗的山藥為河南焦作的懷山藥，具有補脾養胃，生津益肺，補腎澀精［1］的功效，是著名的四大懷藥之一，在中醫臨床上應用極為廣泛。懷山藥含淀粉、蛋白質、游離氨基酸等營養成分以及多糖 (包括黏液質和糖蛋白)、尿囊素、淀粉酶、甾醇類、皂苷類等活性成分［2-9］，在軟化切制藥材時，泡潤過度這些成分就會流失，還給飲片干燥帶來困難，泡潤不透切片時就會沾刀、易碎。《中國藥典》2010年版山藥炮制項載“除去雜質，分開大小個，泡潤至透，切厚片，干燥”，藥典沒有規定具體參數，目前關于懷山藥軟化切制方面的研究也未見報道，而炮制上有“七分潤工，三分刀工”的說法，說明切制前的軟化是影響飲片質量的一個重要環節［10-12］。本實驗通過正交試驗設計篩選懷山藥軟化切制最佳工藝，為懷山藥加工生產和質量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 懷山藥“光條”購自河南省焦作市武陟縣，經本院生藥教研室董誠明教授鑒定為薯蕷科植物薯蕷 Dioscorea opposita Thunb．的干燥根莖;尿囊素對照品 (中國藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用，編號100431-200401);甲醇為色譜純 (天津四友)，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 LC—20A高效液相色譜儀 (日本島津);METTLER AE240十萬分之一精密天平 (瑞士);Sartorious BS224S萬分之一精密天平 (北京賽多利斯公司);DZKW—4型水浴鍋 (上海東星建材實驗設備有限公司);GS101—2D電熱鼓風干燥器 (重慶四達實驗儀器有限公司)。

2 方法和結果

2.1 尿囊素測定

2.1.1 色譜條件 迪馬鉑金ODS-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，0.5μm);流動相為甲醇-水 (97∶3);體積流量0.7 mL/min;檢測波長224 nm，柱溫25℃，進樣量10μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取尿囊素約5.2 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加20%甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻作為貯備液 (1.04 mg/mL)。

2.1.3 線性關系考察 取貯備液分別配制成質量濃度為1.04、0.52、0.26、0.13、0.065、0.032 5 mg/mL的溶液，精密吸取10μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為:y=208 328x+11 938(r=0.999 8)，表明尿囊素在0.325～10.4μL間線性關系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL，連續進樣6次，記錄峰面積，計算其RSD值為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取樣品6份，按供試品溶液的制備方法處理后，按上述色譜條件進樣10μL，記錄峰面積，計算尿囊素的量，RSD值為0.38%，表明方法重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液10μL，分別在2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，計算RSD為0.32%，表明供試品溶液常溫下在24 h內穩定。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品0.5 g，共6份，分別精密加入一定量對照品，其余按供試品溶液制備方法操作制得供試品溶液，精密吸取10μL進樣，計算得平均回收率為99.8%，RSD為1.01%(n=6)。

2.1.8 供試品溶液的制備及樣品測定 取各干燥樣品粉碎，過40目篩，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質量，用20%甲醇補足減失質量，搖勻，過濾，取續濾液過0.45μm微孔濾膜，再取續濾液即得供試品溶液。分別進樣10μL，用外標法計算。

2.2 浸出物測定 浸出物按照2010年版《中國藥典》一部附錄XA浸出物測定法測定，其中水溶性浸出物采用冷浸法。

2.3 單因素考察

2.3.1 浸泡時間的考察 取大小均勻一致干燥至恒定質量的懷山藥400 g，置儲水容器中，加約3L水淹沒過藥面，每隔5 h測定一次吸水量，結果見圖1。

吸水量=(浸泡后總藥材濕質量－總藥材干質量)/總藥材干質量×100%

圖1 懷山藥浸泡吸水率測定結果Fig.1 Determination results of water absorption rate

由圖1可見，浸泡時間在16 h之前曲線上升比較平緩，16 h之后曲線上升開始變陡，表明藥材內部水分擴散速度加快，有效成分流失應該發生在水分擴散加快過程［4］。

2.3.2 悶潤時間考察 取經過浸泡的藥材，置密閉的潤藥缸內，整齊堆放，均勻噴淋清水，經常翻動檢查，保持藥材濕潤狀態，直到藥材到達內外軟硬一致便于切片目的。結果見表1。

表1 悶潤時間考察結果Tab.1 Investigation results of moistening time

由表1可見，悶潤時間過短不能達到軟化切制目的，時間過長容易發霉，也給后期干燥帶來困難，結合切片情況用彎曲法看藥材的“水性”，藥材略彎曲，而不易折斷，即為合格。

2.4 因素水平設計及正交實驗

2.4.1 因素水平設計 依據《中國藥典》2010年版 (一部)附錄ⅡD關于藥材炮制通則切制項下的有關規定，以浸泡時間、悶潤時間、干燥時間、干燥溫度為考察因素，每個因素取三個水平，因素水平表如下 (表2)。

表2 懷山藥軟化切制工藝因素水平Tab.2 Factor-level table of softening and cutting process

2.4.2 正交試驗安排 取大小均勻的懷山藥“光條”按正交試驗表組合平行9份，用清水泡潤至便于切片，烘干，得到9個不同條件下的樣品，分別編號為1～9。各指標評分方法為:把含尿囊素量最大的樣品定位100，其它各樣品與該列最大值相比，再乘以100，即得該樣品得分，浸出物含有量評分方法相同。確定尿囊素x、水溶性浸出物y、醇溶性浸出物z的權重系數分別為0.4、0.3、0.3，通過公式W=0.4x+0.3y+0.3z，得到綜合評分W，正交試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 正交試驗表及結果Tab.3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of variance analysis

直觀分析結果，影響因素大小的順序為:A＞B＞C＞D。方差分析結果表明:A和B因素對試驗結果有極顯著意義，C因素對試驗結果有顯著意義，D因素對試驗結果無顯著意義。結合直觀分析和方差分析及生產實際，確定最佳搭配為A1B2C2D1，即懷山藥軟化切制的最佳方案為:浸泡10 h，后悶潤22 h，切片厚度為3 mm，70℃干燥2.5 h。

2.4.3 最佳方案的驗證試驗 取400 g懷山藥“光條”按A1B2C2D1處理，重復3次，試驗結果見表5。

表5 驗證試驗結果Tab.5 Results of verification test

由表5可見，采用優化后工藝進行懷山藥的軟化切制，其指標性成分含有量都較高，且工藝條件穩定，重復性好。

3 討論

3.1 《中國藥典》2010年版要求山藥應切成厚片，藥典附錄中規定厚片的厚度為2～4 mm，考慮到懷山藥粉性的質地，切制過薄在炒制、干燥時易碎邊，煎煮時藥汁濃度高，影響其他配伍藥材的有效成分煎出;過厚則影響藥材本身的有效成分煎出，因此本實驗的切片厚度定為3 mm。

3.2 本實驗選擇水溶性浸出物和醇溶性浸出物作為指標，是很有代表性的，因為懷山藥中多糖、黏液蛋白、淀粉酶、游離氨基酸水溶性較強;尿囊素和皂苷類成分醇溶性較強。采用多指標綜合評判優選懷山藥飲片的軟化切制工藝條件，符合中藥綜合作用的特點。

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