藿香正氣膠囊微生物限度檢查法驗證

胡 林，翁永京，萬小玲，黃麗紅

(四川泰華堂制藥有限公司，四川廣漢 618300)

藿香正氣膠囊微生物限度檢查法驗證

胡 林，翁永京，萬小玲，黃麗紅

(四川泰華堂制藥有限公司，四川廣漢 618300)

為建立藿香正氣膠囊微生物限度檢查驗證方法，采用多種陽性菌作為對照菌，采用回收率試驗測定其抑菌成分對微生物限度檢查的影響.根據(jù)回收率試驗結果，藿香正氣膠囊抑菌成分對微生物限度檢查影響較大，通過系統(tǒng)性設置試驗，表明薄膜過濾法、離心沉淀薄膜過濾法能消除其影響，但薄膜過濾法中枯草芽孢桿菌回收率相對較低，抑菌成分消除不徹底，而離心沉淀集菌薄膜過濾法能完全、徹底消除其抑菌作用.

微生物限度檢查;抑菌成分;薄膜過濾;驗證

0 引言

藿香正氣膠囊是一種具有解表化濕，理氣和中功效的，含有廣藿香、紫蘇葉、白芷、白術、陳皮、厚樸、茯苓、桔梗、甘草、大腹皮等成分的中成藥，常用于外感風寒、內傷濕滯、頭痛昏重、胸隔痞悶、脘腹脹痛和嘔吐泄瀉等癥的治療.由于本品為含有多種抑菌成分的中藥材制劑［1-17］，按《藥典》規(guī)定，含抑菌成分的中成藥的微生物限度檢查［20-21］必須在消除供試液抑菌活性后，再按規(guī)定的方法進行檢查.同時，還需對所采用檢測方法進行驗證試驗，以確認供試品的抑菌活性和保證測定方法的可靠性.據(jù)此，本研究對藿香正氣膠囊微生物限度檢查法進行方法驗證，以評價本品微生物限度檢查方法的可行性，規(guī)范微生物限度檢查方法，進而提供產(chǎn)品質量控制依據(jù).

1 儀器與材料

1.1 儀器

實驗所用的儀器包括:生化培養(yǎng)箱、顯微鏡、立式電熱蒸汽消毒器、天平、ZF-1型紫外燈、電熱鼓風干燥箱、恒溫水浴鍋、平皿(直徑90 mm)、接種針、振蕩器、酒精燈、離心機等.

1.2 樣品

實驗所用的樣品為藿香正氣膠囊，由四川泰華堂制藥有限公司生產(chǎn)(批號為，110201、110601、120301).

1.3 培養(yǎng)基

實驗中，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計數(shù)，膽鹽乳糖培養(yǎng)基用于大腸埃希菌培養(yǎng).

1.4 實驗菌株

實驗所有菌株包括:大腸埃希菌 CMCC(B)(44102)、金黃色葡萄球菌CMCC(B)(26003)、枯草芽孢桿菌 CMCC(B)(63501)、白色念珠菌 CMCC(F)(98001)和黑曲霉CMCC(F)(98003)，所有菌株均由中國藥品生物制品檢定所提供.

2 方法與結果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證

按照文獻［20］中“細菌、霉菌及酵母菌項下計數(shù)方法的驗證”方法對本品進行計數(shù)方法的驗證，同時參考國家藥典委員會網(wǎng)上公布之相關方法.

2.1.1 常規(guī)法.

為明確本品驗證的過程，確保驗證不受常規(guī)法分析的干擾，故做常規(guī)法的驗證.

1)對照用菌液的制備.取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌肉湯培養(yǎng)物1 mL，加0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋制成每1 mL中含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用.取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物，加0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1 mL中含菌數(shù)為50～100 cfu的菌懸液，備用.取經(jīng)20～25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加3～5 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗一下，用帶有棉花的球形吸管取出菌液至無菌試管內，加0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL中含孢子數(shù)為50～100 cfu的孢子懸液，備用.

2)供試液的制備.無菌操作稱取供試品10 g，置入100 mL 40℃的pH值為7.0的無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中，充分振搖后靜置，吸取上清液，作為1∶10的供試液.

3)回收率測定.

①試驗組.取供試液1 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，同時加入50～100 cfu試驗菌株，注入10～20 mL溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，每株試驗菌平行制備2個平皿，記錄其菌數(shù)，測定回收率.

②供試品對照組.取供試液1 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu試驗菌株加入無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取稀釋劑1 mL，加入50～100 cfu試驗菌株，注入10～20 mL溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

4)結果.細菌培養(yǎng)48 h，逐日點計菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點計菌落數(shù).實驗結果表明，實驗中所有枯草芽孢桿菌回收率均未達到70%，故考慮采用培養(yǎng)基稀釋法進行驗證.

2.1.2 培養(yǎng)基稀釋法.

1)對照用菌液和供試液的制備，同常規(guī)法.

2)回收率測定.

①試驗組.分別取供試液0.2 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，同時加入50～100 cfu試驗菌株，注入10～20 mL溫度不超過45℃的溶化的營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng).每株試驗菌平行制備2個平皿，記錄其菌數(shù)，測定回收率.

②供試品對照組.取供試液0.2 mL，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu試驗菌株加入無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取稀釋液0.2 mL，加入50～100 cfu試驗菌株，加入直徑為90 mm的無菌平皿中，按試驗組方法操作全過程.每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

3)結果.細菌培養(yǎng)48 h，逐日點計菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點計菌落數(shù).實驗結果表明，實驗組枯草芽孢桿菌回收率仍未達到70%，故考慮采用薄膜過濾法進行驗證.

2.1.3 薄膜過濾法.

1)對照用菌液和供試液的制備，同常規(guī)法.

2)回收率試驗.

①試驗組.取供試品原液1 mL，用pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液50～100 mL稀釋后，混勻，加入薄膜過濾器中，過濾.用無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌株，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，測定回收率.

②供試液對照組.取供試品原液1 mL，用pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液50～100 mL稀釋后，混勻，加入薄膜過濾器中，過濾.用無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu/mL試驗菌株加加入無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取緩沖液100 mL和50～100 cfu試驗菌株加入薄膜過濾器中，過濾，后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每株試驗菌平行制備2個平板.

⑤培養(yǎng)和計數(shù).細菌培養(yǎng)48 h，逐日點計菌落數(shù)，一般以48 h的菌落數(shù)報告;霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點計菌落數(shù)，一般以72 h的菌落數(shù)報告.點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌落報告規(guī)則報告菌落.

3)結果.細菌培養(yǎng)48 h，逐日點計菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點計菌落數(shù).結果見表1、表2.

表1、2結果表明，以上各次實驗回收率均在70%以上，表2結果表明，以上各次實驗回收率均在70%以上，可采用薄膜過濾法進行驗證.但該方法中枯草芽孢桿菌回收率有待進一步提升.為保證徹底消除產(chǎn)品中抑菌成分，同時保證回收率實驗穩(wěn)定、可行，故考慮采用離心沉淀集菌薄膜過濾法進行驗證.2.1.4 離心沉淀集菌薄膜過濾法.

1)對照用菌液和供試液的制備，同常規(guī)法.

表1 薄膜過濾法驗證實驗(試驗組菌回收率)結果表

表2 薄膜過濾法驗證實驗(稀釋劑對照組菌回收率)結果表

2)回收率測定.

①試驗組.吸取供試液10 mL，于已滅菌的具塞離心管內，以500 r/min離心5 min，取上清液1 mL，用pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液100 mL稀釋，混勻.加入薄膜過濾器中，過濾.用 pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖洗，100 mL/次，分別試驗，每膜沖洗3次和5次，在最后一次沖洗液中加入50～100 cfu試驗菌株，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板，測定回收率.

②供試品對照組.取供試液1 mL，用pH值7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液100 mL稀釋，混勻.加入薄膜過濾器中，過濾.沖冼液100 mL/次，分別實驗，每膜沖洗3次和5次，過濾后取膜貼于瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng).每種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

③活菌試驗組.取50～100 cfu試驗菌株加入無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng).每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

④稀釋劑對照組.取試驗用稀釋液10 mL，按試驗組供試液制備方法操作全過程.每個菌種計數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個平板.

3)結果.細菌培養(yǎng)48 h，逐日點計菌落數(shù);霉菌、酵母菌培養(yǎng)72 h，逐日點計菌落數(shù).結果見表3～表6.

表3 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(試驗組菌回收率試驗)結果表(沖洗液300 mL/膜;n=3)

表4 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(稀釋劑對照組菌回收率試驗)結果表(沖洗液300 mL/膜)

表5 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(試驗組菌回收率試驗)結果表(沖洗液500 mL/膜;n=3)

表6 離心沉淀集菌薄膜過濾法驗證實驗(稀釋劑對照組菌回收率試驗)結果表(沖洗液500 mL/膜)

表3～6結果表明，以上各次實驗回收率均在80%以上.

實驗驗證結果表明，薄膜過濾法對照菌的回收率均雖然達到70%以上，但該實驗方法中枯草芽孢桿菌回收率相對較低，抑菌成分消除不徹底.離心沉淀集菌薄膜過濾法對照菌的回收率均達到80%以上，徹底消除了抑菌成分.同時，實驗中還發(fā)現(xiàn)，該法隨著沖洗量的增加，測定對照菌的回收率反而有下降的趨勢，且實驗過程中易出現(xiàn)濾膜破損等情況，故選擇沖洗液沖洗量為300 mL/膜的離心沉淀集菌薄膜過濾法.

2.2 控制菌檢查法的驗證

按照文獻［20］中“控制菌檢查法的驗證”進行驗證.

2.2.1 供試液的制備.

無菌操作稱取供試品10 g，置入100 mL 40℃的pH值為7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液中，充分振搖，靜置，吸取上清液，作為1∶10的供試液.

2.2.2 驗證實驗.

1)試驗組.取供試液10 mL至緩沖液100 mL中，混勻.加入薄膜過濾器中，用無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液沖冼，100 mL/次，每膜沖洗2次，在最后一次沖洗液中加入10～100 cfu試驗菌株，過濾后取膜加入增菌培養(yǎng)基中，按照相應控制菌檢查法檢查.

2)陰性菌對照組.取10～100 cfu金黃色葡萄球菌加入增菌培養(yǎng)基中，按照相應控制菌檢查法檢查，作為大腸埃希菌陰性對照.

驗證實驗結果如表7所示.

表7 驗證實驗結果表(n=3)

表7數(shù)據(jù)表明，以上各次實驗驗證的控制菌檢查方法專屬性較強、方法可行.

3 討論

中藥成分復雜，許多成分都有不同程度的抑菌作用，因而有必要根據(jù)各個品種、各個企業(yè)具體生產(chǎn)工藝，通過不同方法驗證實驗確立適宜的微生物限度檢驗方法.

本研究中的藿香正氣膠囊，其藥材品種較多，各藥材抑菌成分復雜，且相互交替影響，故對微生物限度驗證方法的選用具有典型意義.

本研究對藿香正氣膠囊制劑生產(chǎn)過程中使用醇沉工藝、大孔樹脂工藝的品種的微生物驗證做了初步的研究，驗證了薄膜過濾法、離心沉淀集菌薄膜過濾法等方法.實驗發(fā)現(xiàn)，離心沉淀集菌薄膜過濾法以低速500 r/min離心，再以高速3 000 r/min離心集菌較為適宜，沖洗量達到300 mL時可消除抑菌作用，但隨著沖洗量增加，易出現(xiàn)濾膜破損等不易控制情況.

:

［1］蘇鏡娛，張廣文，李核，等.廣藿香精油化學成分分析與抗菌活性研究(Ⅰ)［J］.中草藥，2001，32(3):204-208.

［2］莫小路，朱慶玲，陳瑜珍，等.幾種植物精油的抗菌作用研究［J］.中成藥，2010，23(7):1213-1215.

［3］莫小路，嚴振，王玉生，等.廣藿香精油對植物病原真菌的抑菌活性研究［J］.中藥材，2004，27(11):805-808.

［4］郭群群，杜桂彩，李榮貴.紫蘇葉揮發(fā)油抗菌活性研究［J］.食品工業(yè)科技，2003，25(9):25-28.

［5］吳媛媛，蔣桂華，馬逾英，等.白芷的藥理作用研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(3):625-629.

［6］呂圭源.白術抗衰老作用研究［J］.現(xiàn)代應用藥學，1996，13(5):266-269.

［7］枝鳳，梁逸曾，邱細敏，等.白術揮發(fā)油成分分析及其色譜指紋圖譜研究［J］.中草藥，2004，35(1):5-9.

［8］文高艷，周賢梅.陳皮有效成分在呼吸系統(tǒng)中的作用研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2011，20(3):385-389.

［9］方玉復，魏玉平，于香安，等.陳皮對淺部真菌的試管內抑菌實驗報告［J］.蘭州大學學報(醫(yī)學版)，1997，23(1):34-35.

［10］李興春，馬經(jīng)野，聶俊秀.吉林省中草藥對變形鏈球菌抑菌的研究［J］.口腔醫(yī)學研究，1987，3(2):65-68.

［11］李鳴宇，朱彩蓮，劉正.天然植物提取物對變鏈菌胞外多糖的抑制［J］.現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志，2004，18(6):481-484.

［12］鄧淑華，王曉斌，王鴻梅，等.甘草酸鹽抗菌作用的實驗研究［J］.承德醫(yī)學院學報，2011，28(3):325-328.

［13］周邦靖.幾種中藥在試管內對金黃色葡萄球菌凝固酶形成及白細胞吞噬作用的影響［J］.成都中醫(yī)學院學報，1978，4(1):73-76.

［14］張采，李佳，張永清.大棗化學成分研究概況［J］.中國現(xiàn)代中藥，2011，13(11):49-52.

［15］關俊玲，李明潤，高向耘，等.不同產(chǎn)地大棗化學成分的含量分析［J］.天津藥學，2002，14(3):82-85.

［16］謝永芳，梁亦龍，楊仙，等.生姜內生菌抗菌蛋白提取及性質［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(9):43-47.

［17］關洪全，李海波.生姜對常見污染食品真菌抗菌活性的探討［J］.遼寧中醫(yī)學院學報，2000，2(3):216-219.

［18］張廣波.微生物肥料應用系列報道生姜栽培中使用生物多抗菌肥的情況(一)［J］.中國農(nóng)業(yè)信息，2005，17(8):43-47.

［19］周孟清.生姜提取物的抗菌作用及應用［J］.養(yǎng)殖技術顧問，2005，33(10):17-21.

［20］國家藥典委員會.中國藥典(一部)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［21］馬緒榮.藥品微生物學檢驗手冊［M］.北京:科學出版社，2000.

Validation of Microbial Limit Test of Huoxiangzhengqi Capsule

HU Lin，WENG Yongjin，WANG Xiaoling，HUANG Lihong
(Sichuan Taihuatang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guanghan 618300，China)

A variety of Gram-positive bacteria are used as the control bacteria.The recovery test determines the impact of antifungal composition on microbial limit tests.According to the results of the recovery test，Huoxiangzhengqi capsule antifungal composition has great effect on the microbial limit test.Through the systematic set to test，the results show that the membrane filtration，centrifugation and membrane filtration method can eliminate its influence.But in the membrane filtration method，bacillus subtilis recovery rate is relatively low and antibacterial ingredients can＇t be eliminated thoroughly.The centrifugal sedimentation and membrane filtration method can eliminate the antimicrobial effect completely and thoroughly.

microbial limit test;antifungal composition;membrane filtration;verification

R284

A

1004-5422(2013)03-0224-05

2013-07-05.

胡 林(1974—)，男，工程師，從事中藥新制劑研究.