不同誘導(dǎo)階段的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔骨損傷的實驗研究

朱莎 凌斌 孫潔

因創(chuàng)傷或疾病造成的骨損傷極為常見。近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的臨床應(yīng)用已成為研究的熱點[1-5]。BMSCs在不同誘導(dǎo)劑的作用下，定向分化為各種組織的成體細(xì)胞前，都可能階段性地處于對應(yīng)的前體細(xì)胞或前體干細(xì)胞的狀態(tài)，亦或是各種“專能干細(xì)胞”的狀態(tài)。而目前國內(nèi)尚無BMSCs誘導(dǎo)分化不同階段細(xì)胞移植治療組織損傷修復(fù)的療效評價和報道。本實驗將BMSCs誘導(dǎo)分化不同階段的細(xì)胞移植入骨損傷動物模型，比較不同分化階段的細(xì)胞對組織損傷修復(fù)的療效，確定最適宜移植的細(xì)胞時間和狀態(tài)，從而最大程度發(fā)揮BMSCs在組織損傷修復(fù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑和儀器

H-DMEM培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibco公司，美國），CD34、CD45 、CD73、CD105 抗體、 慢病毒包裝質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒：Vivid color TM pLenti6.2-GW/EmGFP Expression Control Vector及ViraPowerTM Lentivirus Expression System（Invitrogen公司，美國），蘇木精、伊紅（上海美季生物技術(shù)有限公司），胰蛋白酶、二甲基亞砜、4%多聚甲醛（Sigma公司，美國），堿性磷酸酶染液（南京建成科技有限公司）。

SW-CJ-2F百級層流超凈工作臺 （蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司），Heal Force HF240細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），全自動脫水機、組織包埋機HISOCENTREZ（Shandon 公司，英國），流式細(xì)胞儀（BD Calibur公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（LSM500，德國），外科手術(shù)器械（中國科學(xué)院昆明動物研究所提供）。

正常健康新西蘭大耳白兔40只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 Kg，由中國科學(xué)院昆明動物研究所實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部 《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 兔尺骨骨折模型的制備

參考前期兔開放型骨折模型制備方法[6-8]，大耳白兔電子秤上秤重，10%水合氯醛3.5 mL/Kg腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺。兔仰臥位，左上肢備皮。于左前肢中段掌外側(cè)作縱形切口，切開皮膚及皮下組織，暴露尺骨中段，環(huán)形切開相應(yīng)長骨膜，不銹鋼鋸條沿兩端點鋸斷尺骨，形成5 mm長的缺口，注意使兩斷端平面盡量保持平行且避免過度傾斜。青霉素沖洗，切口逐層縫合包扎，不行任何固定。術(shù)后每日肌注青霉素400 000 U/只，連續(xù)3 d。造模后立即在麻醉下拍攝患肢正位X線片，了解骨折類型及移位程度，要求骨折類型為橫斷型，無明顯移位。

1.2.2 BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定

2%利多卡因2 mL局部浸潤麻醉大耳白兔，股骨髓腔內(nèi)抽取骨髓約3～4 mL，加入40 mL PBS稀釋，2 000 r/min離心3 min，棄上清，重復(fù)3遍。重懸細(xì)胞，加入3.5 mL紅細(xì)胞裂解液，冰板上持續(xù)搖晃30 min，破碎紅細(xì)胞，待紅細(xì)胞充分裂解后加入PBS至10 mL，3 000 r/min離心3 min，棄上清，再洗滌3遍。細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸，移入含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液的5 mL培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，棄掉懸浮的單個核細(xì)胞及培養(yǎng)液，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，每隔3～4 d換液，按1∶2傳代。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)至第 3 代的細(xì)胞表面抗原 CD34、CD45、CD73（SH3）、CD105（SH2）進(jìn)行表型鑒定。

1.2.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因標(biāo)記

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法，將含綠色熒光蛋白的慢病毒轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以ViraPowerTM Lentivirus Expression System制備慢病毒。將質(zhì)粒用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)導(dǎo)入?yún)R合度80%的293FT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)導(dǎo)后12 h換新鮮培養(yǎng)基，換液后48～72 h收集培養(yǎng)基，用0.45 μm的濾膜過濾培養(yǎng)基，超速離心機25 000 r/min，4℃離心3 h，100倍濃縮病毒。在無抗生素條件下，將病毒添加到培養(yǎng)基中，和BMSCs共培養(yǎng)8 h后，換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4 BMSCs向前體骨細(xì)胞的定向誘導(dǎo)

用傳至第3代的BMSCs計數(shù)后接種于6孔板中。次日半量換液，改成含有地塞米松0.1 μmol/L、維生素 C 50 μmol/L、β-甘油磷酸鈉 10 μmol/L 及含10%FBS的H-DMEM的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。以后每2～3天換液，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5 不同分化階段的細(xì)胞移植

胰酶消化各階段細(xì)胞，制備成1×106cells/mL的2 mL細(xì)胞懸液，按照3×106cells/Kg注射兔骨損傷模型，注射速度為1 mL/min；對照組注入等量HDMEM培養(yǎng)基，并觀察移植后組織綠色熒光表達(dá)。

1.2.6 移植后X線片觀察

分別于移植后第2、4、6周時，攝X線片，讀片采用盲法，評價兩項參數(shù)。根據(jù)骨折愈合過程中外骨痂和骨折線的變化規(guī)律，將外骨痂和骨折線進(jìn)行半定量檢測[9]。

外骨痂定量：0分，外骨膜無反應(yīng)；1分，外骨膜出現(xiàn)反應(yīng)；2分，外骨痂大小或密度較前明顯提高；3分，外骨痂連在一起形成皮質(zhì)骨橋；4分，外骨痂輕度吸收；5分，外骨痂明顯吸收；6分，外骨痂接近完全吸收，骨折處皮質(zhì)骨密度接近正常皮質(zhì)骨。

骨折線定量：0分，骨折線清晰無變化；2分，骨折線開始變?yōu)槟：?分，骨折線模糊未消失，但出現(xiàn)較牢固的連接跡象；6分，骨折線己消失，骨折線被高密度的骨痂取代；8分，骨髓腔處密度開始減低；10分，骨髓腔處密度減低明顯；12分，骨髓腔完全再通。

將評分相加即為骨折愈合的X線評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。全部數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各實驗組的組間及組內(nèi)比較均采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)兔BMSCs的形態(tài)

光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，接種24 h可見部分細(xì)胞貼壁；培養(yǎng)36～48 h后，貼壁的單核細(xì)胞開始增多；5～7 d后，逐漸形成分散的細(xì)胞集落，集落之間彼此相連，細(xì)胞緊密排列，呈旋渦狀、網(wǎng)狀、放射狀向周圍擴(kuò)展，逐漸與鄰近集落相融合；12～14 d，細(xì)胞各個集落間相互融合達(dá)85%，細(xì)胞相互間緊密貼附，單個細(xì)胞呈狹長梭形，大多數(shù)細(xì)胞沿胞體長軸呈有序排列；經(jīng)3～4次傳代后，形成較典型的BMSCs（圖1）。

2.2 兔BMSCs表面抗原的流式細(xì)胞分析

結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的BMSCs不表達(dá)血細(xì)胞表面標(biāo)記，如CD34、CD45；表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記 CD73、CD105（圖 2）。

2.3 兔BMSCs的GFP標(biāo)記

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，慢病毒轉(zhuǎn)染后培育48 h，GFP標(biāo)記的BMSCs顯示綠色熒光（圖3）。

2.4 BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化

BMSCs誘導(dǎo)3 d后，細(xì)胞增殖旺盛，呈漩渦狀生長，融合成單層，細(xì)胞形態(tài)仍保持長梭形。誘導(dǎo)7 d時，細(xì)胞增殖速度減慢，開始出現(xiàn)細(xì)胞聚集的現(xiàn)象，細(xì)胞逐漸匯合呈鋪路石狀，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由梭形變?yōu)榘w較小的立方形，高倍鏡下可見細(xì)胞呈復(fù)層生長。誘導(dǎo)8～10 d時，細(xì)胞呈多角形成骨樣細(xì)胞，胞質(zhì)顏色變深，含粗大顆粒，胞核明顯，胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，膠原堆積，鈣鹽沉積。誘導(dǎo)14 d時，形成不透光、散在褐色點狀礦化結(jié)節(jié)中心。誘導(dǎo)21 d時，礦化結(jié)節(jié)連接成小片狀（圖4）。誘導(dǎo)28 d時，細(xì)胞開始從培養(yǎng)皿壁脫落，見大量懸浮死細(xì)胞。

2.5 受體組織熒光表達(dá)檢測

移植后熒光顯微鏡觀察顯示骨組織內(nèi)有移植細(xì)胞存在，可見散發(fā)綠色熒光（圖5）。

2.6 不同階段細(xì)胞移植后的療效評價

未誘導(dǎo)組同誘導(dǎo)7 d和21 d組造模后第6周時骨髓腔仍未通。3 d組在細(xì)胞移植后第2周時外骨痂量較多，骨折間隙處密度開始增高，部分骨折線呈現(xiàn)較牢固連接跡象；第4周時外骨痂開始吸收，骨折線消失，被高密度的骨痂取代；第6周時外骨痂接近完全吸收，骨折處皮質(zhì)骨密度接近正常皮質(zhì)骨，骨髓腔完全再通。誘導(dǎo)7 d組和21 d組細(xì)胞移植后第2周時骨折線模糊，出現(xiàn)少量外骨痂，骨折線尚未出現(xiàn)牢固連接跡象；第4周時大量的外骨痂，骨折線出現(xiàn)牢固連接跡象，但外骨痂無吸收；至造模后第6周骨折線消失，外骨痂開始吸收，骨髓腔仍未通。對照組中有出現(xiàn)斷端硬化不愈合現(xiàn)象。

BMSCs未誘導(dǎo)組、誘導(dǎo)7 d和21 d組無明顯差異（P>0.05），且均顯著高于對照組（P<0.01），3 d 組評分高于7 d和21 d組（P<0.05），且顯著高于對照組（P<0.01）（表1）。

圖1 第三代 BMSCs（100×）Fig.1 BMSCs of passage 3(100×)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面抗原Fig.2 Surface antigen of BMSCs detected by FCM

圖3 GFP標(biāo)記的BMSCs（100×）Fig.3 GFP labeled BMSCs(100×)

圖4 BMSCs誘導(dǎo)21 d（100×）Fig.4 BMSCs after induced for 21 days(100×)

圖5 移植后骨組織切片免疫熒光檢測（20×）Fig.5 Immunofluorescence detection of bone tissue after transplantation(20×)

3 討論

骨折愈合是一個緩慢而復(fù)雜的過程，存在許多影響愈合的因素。骨折的傳統(tǒng)治療方法存在一定局限性，如治療周期長、操作復(fù)雜、醫(yī)藥費用高、不良反應(yīng)多等。近年來，隨著BMSCs研究的不斷深入，BMSCs的移植治療已有望應(yīng)用于臨床。

研究顯示，多種因素的綜合影響誘導(dǎo)了相關(guān)發(fā)育基因在序列上的改變，促使干細(xì)胞向不同組織細(xì)胞分化[10-13]，并且有的研究認(rèn)為誘導(dǎo)的細(xì)胞更優(yōu)于干細(xì)胞本身[14-15]。在誘導(dǎo)劑的作用下，BMSCs來源的前體細(xì)胞或前體干細(xì)胞的功能在整個被誘導(dǎo)過程中并不是一成不變的。因此，把不同功能狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植后可能會產(chǎn)生不同的效果。本實驗將誘導(dǎo)分化不同階段的BMSCs移植入骨損傷動物模型，比較不同階段的“前體干細(xì)胞”應(yīng)用于骨損傷修復(fù)時產(chǎn)生的效果差異，從而最大程度發(fā)揮BMSCs在組織損傷修復(fù)中的作用。

X線片顯示的骨折線模糊程度，基本反應(yīng)了骨痂變化，外骨痂評分說明骨外膜形成和塑形情況。X線評分近似地反映骨折愈合過程的各個階段變化，從而有利于比較各組骨折愈合程度。通過移植細(xì)胞后2、4、6周的X線觀察及分析，未誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)7 d和21 d組比較無明顯差異，3 d組治愈程度明顯優(yōu)于對照組，且優(yōu)于未誘導(dǎo)組和7、21 d組。從而證明了成骨誘導(dǎo)3 d較BMSCs和成體細(xì)胞更能加速骨痂形成與鈣化，加快骨塑形，提高骨折愈合速度。證明了BMSCs和BMSCs誘導(dǎo)分化的前體骨細(xì)胞在骨損傷治療上都發(fā)揮了作用，但BMSCs成骨誘導(dǎo)3 d組療效更為顯著，很有可能是最適宜移植的。

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