不同代次小鼠脂肪干細胞增殖能力及體外成脂能力的實驗研究

蔣婷 楊澤龍 白倩 周廣東 劉偉

成體干細胞可來源于骨髓、脂肪、皮膚、肌肉、角膜等各類組織[1-5]，脂肪干細胞（Adipose-derived stem cells，ASCs）因其在體內分布廣、取材創傷小、細胞獲得量大等優點，成為間充質干細胞新的研究熱點。大量的研究已經證實，ASCs有向多個譜系分化的潛能（骨、軟骨、脂肪、神經、肌、內皮等）[6-12]，目前已被廣泛應用于多種組織工程化組織構建的研究中。組織工程化組織構建需要大量優質的種子細胞，一般而言，較早代次的種子細胞活力好、干細胞特性強，但細胞數量有限，很難達到組織構建對細胞量的需求，需要在體外多次傳代擴增，細胞代次擴增一次，數量可增加3倍左右。但也不能無限制地擴增，成體干細胞在體外培養擴增過程中易于老化，多次傳代后細胞增殖減慢，分化潛能降低[13-15]。因此，需要觀察不同代次細胞的增殖能力及分化能力。眾所周知，間充質干細胞具有向脂肪誘導分化的潛能，脂肪干細胞因其來源的特殊性，其成脂分化能力與其他組織來源的間充質干細胞有所不同。在我們研究ASCs成脂分化能力時，并未考慮脂肪前體細胞的作用。因此，有必要對ASCs自發成脂能力及誘導成脂分化潛能進行探討。本實驗通過對不同代次mASCs增殖能力、體外自發成脂能力及誘導成脂分化潛能的觀察分析，為優化組織工程種子細胞提供更多參數，為組織工程化組織構建種子細胞的合理選用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

6～8周齡C57BL/6小鼠（野生型小鼠，wild type）購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。膠原酶NB4（包含Ⅰ型膠原酶，Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶）購于Serva公司，DMEM購于HyClone公司，胎牛血清購于SAFC Bioscience公司，Mx3000P熒光定量PCR儀購于美國Stratagene公司，逆轉錄試劑購于Promega公司，定量PCR試劑POWER SYBY Green PCR Master Mix購于美國Applied Biosystems公司，定量PCR引物由上海生工生物公司合成，其余試劑均購于Sigma公司。

1.2 mASCs體外分離與培養

取6～8周齡雌性C57BL/6小鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡15 min，超凈工作臺內無菌條件下暴露腹股溝脂肪，切取并剪碎，放于50 mL離心管中。氯霉素浸泡沖洗15 min后，PBS沖洗3遍，加5倍體積的0.1%膠原酶NB4于37℃恒溫搖床內消化1.5 h，150目無菌尼龍網篩過濾，1 500 r/min離心5 min。棄上清，細胞沉淀用PBS洗滌2次，以含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的低糖DMEM培養液制成細胞懸液培養。將分離收獲在離心管中的細胞懸液以1×105cells/cm2密度接種于培養皿內，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養，3 d后換液，去除未貼壁及懸浮死細胞并加入新鮮培養液。繼續在相同條件下培養，待細胞生長達到90%匯合時即可消化傳代。用0.25%胰蛋白酶消化傳代，以0.5×104～1×104cells/cm2細胞密度接種于新的培養皿內。再次達到90%融合時，繼續傳代培養。

1.3 生長曲線

分別取原代（P0）、第 2 代（P2）及第 5 代（P5）細胞，消化，制備成單細胞懸液。調整細胞懸液濃度為1×104cells/mL，接種 24孔板，每孔接種 1 mL，分 8組，每組3孔。接種第1天用0.25%胰蛋白酶消化第1組，制成細胞懸液1 mL，加入電解液19 mL，對總體積20 mL的細胞懸液，進行計數，取平均值，作為細胞計數的基數（起始數）。第2天開始計數，每天計數1組，取3個孔的均值，至第8天結束。繪制生長曲線，并計算群體倍增時間。

1.4 體外自發成脂能力檢測

分別收集原代（P0）、第二代（P2）及第五代（P5）細胞，將細胞制成5×107cells/mL的細胞懸液，每滴10 μL，接種于六孔板內，每孔接種5滴，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中放置15 min，加入含10%血清的高糖DMEM培養液，繼續培養。3 d更換培養液，不傳代，培養1個月后進行油紅染色、RT-PCR檢測PPARγ及LPL表達水平。

油紅染色：細胞經4%甲醛4℃固定1 h，蒸餾水沖洗，加入60%異丙醇，室溫放置1 min，吸盡后加入2%油紅試劑，室溫放置5～10 min，60%異丙醇洗去多余染液，蒸餾水沖洗后觀察。

1.5 成脂分化潛能檢測

分別收集原代（P0）、第 2 代（P2）及第 5 代（P5）細胞，按1×105個/孔的密度分別接種于6孔板中，進行成脂誘導，誘導液為基礎培養液（高糖DMEM加 入 10%FBS） 加 入 0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L DEX、10 μmol/L insulin、200 μmol/L indomethacin，誘導2周后，進行油紅染色、RT-PCR檢測PPARγ及LPL表達水平。

1.6 RNA抽提，反轉錄及定量PCR

常規抽提細胞RNA，反應液：MgCl2（25 mM）4 μL；10×反應緩沖液 2 μL；無 RNA 酶 H2O 8.5 μL；dNTP混合物 10 mM 2 μL；RNA 酶抑制劑 40 U/μL 0.5 μL；逆轉錄酶5 U/μL 1 μL；隨機引物或寡聚核苷酸引物2.5 pmol/μL或特異的下游引物1 μL；實驗樣品RNA 1 μL（≤1 μg total RNA）。按以下條件進行反轉錄反應：30 ℃，10 min；42 ℃，60 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。

定量PCR試劑POWER SYBY Green PCR Master Mix，應用Mx3000P熒光定量PCR儀，反應條件為：95 ℃，30 sec；57 ℃，30 sec；72 ℃，45 sec，40個循環。Mx3000P分析軟件進行分析。引物設計序列如下。

LPL：產物片段長度219 bp；退火溫度60℃。上游引物5'-AAGCCCTGCTCCTGGTGGTC-3'，下游引物5'-CGAAGGTCTTGCTGCTGTGG-3'。

PPARγ：產物片段長度268 bp；退火溫度58℃。上游引物5'-AGACCACTCGCATTCCTTT-3'，下游引物5'-CCCACAGACTCGGCACTCA-3'。

1.7 統計學分析

各項定量指標均以x±s表示，應用SPSS 11.5軟件包對各定量指標進行統計學分析，兩組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同代次細胞的形態學特點

原代分離的小鼠脂肪干細胞呈體積較小的圓球形，1～2 h開始貼壁生長，6 h左右細胞伸展開來，呈短梭形，隨著傳代，細胞體積增大，傳代后迅速貼壁，貼壁后的細胞逐漸伸展，外觀主要呈長梭型及不規則型，到第5代仍有很強的增殖能力（圖1）。

2.2 生長曲線

生長曲線顯示，培養的P0、P2、P5細胞均具有較強的分裂增殖能力，均出現24 h停滯生長期，第3～4天進入快速增殖期，體外擴增速度相似，均在第6天進入生長停止狀態。P0、P2、P5細胞傳代接種后的潛伏期、對數生長期、平臺期無明顯差異（圖2），群體倍增時間大約為48 h。

2.3 自發成脂能力檢測

小鼠脂肪干細胞局部高密度接種后培養，高密度區域形成密集的圓形、三角形或多角形細胞團，周邊未接種區域細胞亦很快爬滿培養皿，細胞體積較大，呈長梭形或不規則形。培養1個月時，油紅染色發現，P0細胞高密度接種區域有大量的陽性染色（圖3A）；P2細胞高密度接種中心區域亦有陽性染色，但明顯弱于P0細胞（圖3B）；P5細胞高密度接種區域有極少微弱的陽性染色（圖3C）。細胞低密度或爬行生長區域均無陽性染色。

PT-PCR檢測發現，自發分化1個月后，P0細胞PPARγ表達強于P2細胞，P2細胞表達強于P5細胞；LPL表達亦有同樣的趨勢，P<0.05（圖3）。說明隨著培養代次的增加，脂肪干細胞中脂肪前體細胞的數量明顯減少，到第5代時脂肪前體細胞的數量已降至很低。

2.4 誘導成脂分化潛能檢測

成脂誘導7 d左右，P0、P2、P5細胞鏡下觀察均有脂滴出現，隨著誘導時間的延長，脂滴逐漸增多，變大，2周時停止誘導，油紅染色顯示脂滴呈橘紅色，3組細胞無明顯差異。PT-PCR檢測，P0細胞PPARγ及LPL表達略強于P2及P5細胞，但3組PPARγ及 LPL表達均無統計學差異，P＞0.05（圖 4）。說明隨著培養代次的增加，脂肪干細胞中間充質干細胞的含量并未減少，到第5代時仍維持了較好的干細胞特性。

圖1 不同代次 mASCs的細胞形態。 A：P0；B：P2；C：P5。 （標尺：100μm）Fig.1 Morphological observation of different passages of mASCs.A:P0;B:P2;C:P5.(Scale:100 μm)

圖2 不同代次mASCs的生長曲線Fig.2 Growth curve of different passages of mASCs

圖3 不同代次mASCs自發成脂RT-PCR 檢測（A：P0；B：P2；C：P5。 標尺：100 μm）Fig.3 The spontaneous adipogenic ability of different passages of mASCs observed by RT-PCR（A：P0；B：P2；C：P5.Scale:100 μm）

圖4 不同代次mASCs誘導成脂RTPCR 檢測（A：P0；B：P2；C：P5。 標尺：100 μm）Fig.4 The adipogenic potential of different passages of mASCs observed by RT-PCR（A：P0；B：P2；C：P5.Scale:100 μm）

3 討論

通常所說的脂肪干細胞，確切地應該叫脂肪來源細胞，基本參考文獻[2]的方法從脂肪組織中分離培養而獲得，是一個混雜的細胞群，除含有間充質干細胞外，還含有諸如脂肪前體細胞、成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、血管周皮細胞等混雜細胞[16]。脂肪前體細胞是向脂肪細胞分化的特異化的前體細胞，是成熟脂肪細胞的前體，通常不經誘導亦能向脂肪細胞轉化。本實驗觀察了各代小鼠脂肪干細胞的增殖能力、自發成脂能力及誘導成脂潛能，發現隨著培養代次的增加，其增殖能力沒有明顯變化，自發成脂能力明顯降低，而誘導成脂能力基本不變。自發成脂能力與脂肪前體細胞含量有關，而誘導成脂潛能與間充質干細胞含量有關，說明原代細胞中含有更多的脂肪前體細胞，隨著培養代次的增加，含量不斷減少，而間充質干細胞經多次傳代仍能很好地維持干細胞特性。常規的培養體系不利于成熟脂肪細胞及脂肪前體細胞生長，多次傳代培養可能使間充質干細胞優勢生長，降低了脂肪前體細胞及其他混雜細胞的含量，使脂肪干細胞得到一定程度的純化。

應用小鼠脂肪干細胞作為種子細胞時，需要根據構建組織的不同而選擇不同代次的細胞。我們在應用小鼠脂肪干細胞構建組織工程化肌腱的研究中發現，應用較早代次細胞構建的組織工程化肌腱中有脂肪組織形成，而應用較晚代次（5～7代）細胞則不會有脂肪組織形成，能構建出較均質的肌腱樣組織。脂肪干細胞成骨及成軟骨能力均低于骨髓基質干細胞[17-18]，尤其是成軟骨能力，Afizah等[19]認為，脂肪干細胞僅有很弱的成軟骨能力，不適合作為軟骨構建的種子細胞。利用脂肪干細胞構建組織工程化軟骨需要進行分選純化，人脂肪干細胞可利用CD105分選富集軟骨潛能干細胞[20]，目前尚未見應用小鼠脂肪細胞在體外構建出均質組織工程化軟骨的報道，需要進一步研究純化小鼠脂肪干細胞及優化誘導方案。構建脂肪組織時，在保證細胞量足夠的前提下應選擇盡可能早的代次。脂肪干細胞雖具有向骨、軟骨、神經、肌等多個譜系分化的潛能，但其來源于脂肪組織，具有自發成脂分化潛能，是脂肪組織工程理想的種子細胞，有望解決目前臨床應用自體脂肪充填時出現的高吸收率、易液化壞死等問題。

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