臍帶間充質干細胞在遺傳性痙攣性截癱中的應用

劉靜 韓冬梅 王志東 鄭曉麗 丁麗 朱玲 薛梅 閻洪敏 郭子寬 王恒湘

遺傳性痙攣性截癱（HSP）是一組以對稱性雙下肢進行性肌無力和肌張力增高為主要表現的遺傳性神經變性疾病。病情進行性進展，最后喪失自主生活能力，既往缺乏有效治療措施，預后差。臍帶間充質干細胞（UC-MSC）來源于臍帶，易于獲取，體外能夠大量擴增，低免疫原性，具有橫向分化的潛能，在適當的條件下可向外胚層的神經細胞分化。我們采用UC-MSC鞘內注射治療一家系父子2人HSP復雜型，取得一定療效，現報道如下。

1 病例資料

1.1 患者資料

子，17歲，為先證者。于2006年開始出現行走不穩、四肢僵硬，雙手姿勢異常伴活動不利，言語不清楚，癥狀逐漸加重。2010年2月，顱腦MRI示小腦輕度萎縮；肌電圖檢查示左側正中、尺神經運動神經M波潛伏期稍延長，下波100%，sev正常，左側大小魚際肌、胸鎖乳突肌、雙側脛前肌及胸10～11脊旁肌未見自發電位，MUAP稍寬大；X線提示雙手無明顯骨關節病變；查銅蘭蛋白正常。經北京市神經肌肉病協會會診中心會診（編號1938），診斷為HSP復雜型。2009年9月來我院就診，入院查體：意識清楚，語言不清、欠流利。四肢肌力正常，四肢肌張力明顯升高，雙手尤著，致手指運動受限，雙手拇指及食指外展明顯受限。痙攣性剪刀步態，行走不穩，易摔跤，步速減慢，不能走直線，不能跑跳，不能單腿站立，自然站立時足距明顯增大（25～35 cm），閉目難立征陽性（睜、閉眼明顯晃動）。雙側指鼻試驗、指指試驗、輪替試驗、跟膝脛試驗正常。雙眼凝視時有短暫眼震，眼球追蹤檢查者手指時有輕度跳躍，雙眼掃視無辨距不良。肱二頭肌腱反射（++），肱三頭肌腱反射（++），橈骨膜反射（++），膝腱反射（++++），跟腱反射（++++）。 臏、踝陣攣(+)。 診斷：HSP（復雜型）。

父，40歲，于2000年開始出現四肢僵硬，走路、站立不穩，言語不清楚，呈進行性加重，偶有飲水嗆咳。頭顱MRI顯示小腦萎縮。2009年9月來我院，入院查體：意識清楚，口齒略不清、欠流利，四肢肌力正常，四肢肌張力明顯升高，雙下肢尤著。行走呈剪刀步態，行走搖晃、緩慢，轉身困難，不能走直線，不能跑跳，不能單腿站立，自然站立時足距輕度增大（10～25 cm），閉目難立征陽性（睜、閉眼立即摔倒）。雙側指鼻試驗、指指試驗欠穩準，無意向性震顫，雙側輪替試驗、跟膝脛試驗正常。雙眼凝視時有短暫眼震，眼球追蹤檢查者手指時有輕度跳躍，雙眼掃視無辨距不良。雙側肱二頭肌腱反射（++），肱三頭肌腱反射（++），橈骨膜反射（++），膝腱反射（++++），跟腱反射（++++），臏陣攣（-），踝陣攣（+）。 具有家族遺傳病史。 診斷：HSP（復雜型）。

告知患者治療風險，簽署知情同意書，治療方案經醫院醫學倫理委員會批準。兩患者均具有干細胞治療適應證：無發熱、感染，無凝血功能及心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙。

1.2 家系調查

該家系4代共有5人發病，本報道中子系第4代患者，為先證者（圖1）。

圖1 遺傳性痙攣性截癱家系圖譜（→：先證者）Fig.1 Pedigree of a family with HSP(allow:propositus)

2 方法

2.1 UC-MSC的制備

[1]方法，稍加改良后進行UC-MSC制備。即，經知情同意及感染源檢測后收集臍帶，去除外膜和動靜脈，將臍帶剪成0.5 cm3大小的組織塊，加入等體積0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化過夜。次日加入2倍體積的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min離心10 min收集細胞，計活細胞數。將細胞懸浮于hMSC無血清培養基中，按106cells/cm2底面積接種于塑料培養瓶中。1周后出現由數十個形態類似于成纖維細胞組成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6 000 cells/cm2底面積進行傳代培養。利用流式細胞測定細胞表型，常規感染源檢測后，收集細胞用于治療?；蚴斋@細胞置于-80℃冰箱凍存備用，用前在37℃環境下快速復蘇，24～48 h培養，收獲貼壁生長的細胞供臨床應用。

2.2 UC-MSC注射

入院第3或第4天開始給患者行腰椎穿刺，鞘內注射UC-MSC，1次/周，4次為1個療程。常規腰穿，將 UC-MSC 10 mL（每次 1×106cells/kg）+地塞米松5 mg在10 min內緩慢注入蛛網膜下腔，拔針，敷以無菌輔料，囑患者去枕平臥6 h。兩患者于2009年9月接受第1療程治療，于2010年4月接受第2療程治療。

2.3 輔助治療

進行常規系統康復鍛煉。

2.4 評估標準

采用改良Ashworth肌張力分級標準 （MAS）[2]、世界神經病聯合會國際合作共濟失調評分量表（ICARS）[3]及日常生活量表（ADL），對患者治療前及治療后1個月的神經功能及生活質量進行評定，MAS（分 0、1、1+、2、3、4 級，0 級為正常）越高、ICARS及ADL分值越高表示神經功能缺損越嚴重。

2.5 不良反應及并發癥觀察

觀察治療中及治療后有無發熱、腰痛、頭痛、頭暈等不良反應。

3 結果

末次治療結束后隨訪20個月，每個月對患者進行1次隨訪。

子在第一療程治療后，言語流利程度較前改善，四肢肌張力明顯降低，行走站立穩定性提高，自然站立時足距輕度增大（10～25 cm），步速加快，可跑跳，可以走線行走，可單腿站立（10～20 sec），閉目難立征陽性（睜眼正常，閉眼輕度晃動）。余無明顯變化。第二療程治療前發現，患者足距正常（<10 cm），雙眼凝視時短暫眼震消失。第二療程治療后，雙手肌張力較前進一步下降，雙手拇指及食指外展仍輕度受限。雙臂肌張力恢復正常，雙下肢肌張力接近正常，行走接近正常，速度加快，可跑跳，可以走直線，可單腿站立（10～20 sec），可雙足并立下蹲站起。閉目難立征陽性（睜眼正常，閉眼輕度晃動）。雙眼凝視時無眼震，眼球追蹤檢查者手指時無跳躍。余無明顯變化。治療后ICARS評分、ADL評分、改良的Ashworth肌張力分級均降低（表 1、2）。

父在第一療程治療后飲水嗆咳消失，言語較前流利，四肢肌張力下降，行走、站立穩定，行走搖晃減輕，轉身仍困難，閉目難立征陽性（睜眼輕度晃動，閉眼明顯晃動）。右手指鼻穩準，左手指鼻略有偏差，余無明顯變化。第二療程治療前發現，患者行走穩定性增強，轉身自如，但雙手指鼻欠穩準，雙眼凝視時有持續眼震，雙眼掃視時存在辨距不良。第二療程治療后，雙手指鼻試驗恢復正常，余無明顯變化。治療后ICARS評分、ADL評分、改良的Ashworth肌張力分級均降低（表 1、2）。

父子2人每次治療后均無任何不良反應，分別在第二療程治療后7個月及8個月內病情穩定，隨后癥狀均逐漸加重。

表1 患者治療前后ICARS及ADL評分Table 1 ICARS and ADL score before and after the treatment

表2 患者治療前后改良的Ashworth肌張力分級的變化Table 2 Modified Ashworth Scale before and after the treatment

4 討論

遺傳性痙攣性截癱（HSP）是一種罕見的遺傳性脊髓小腦變性病。主要由于皮質脊髓束和脊髓小腦束軸索變性和脫髓鞘所引起，脊髓前角、基底節、小腦、腦干、視神經也可受累。HSP發生率低，國外發病率為0.096‰，國內尚無其流行病學調查結果。HSP有3種遺傳方式，為常染色體顯性遺傳（AD-HSP）、常染色體隱性遺傳 （AR-HSP）和X連鎖隱性遺傳（X-linked HSP），這些遺傳方式中，AD-HSP約占70%[4]。根據臨床表現，HSP可分為單純型和復雜型。該家系有明確的家族遺傳史，連續4代發病，男女皆有，父子倆表現為肌張力增高、腱反射亢進、病理反射陽性、構音障礙、眼球震顫、共濟失調，兒子發病較其父提前。根據家系圖譜遺傳特點和臨床表現，考慮該家系為復雜型HSP，為常染色體顯性遺傳。該病至今無特效藥物治療。由于疾病進行性進展，最終患者將喪失自主生活能力，給患者及家庭造成沉重的負擔。而間充質干細胞（MSC）在修復中樞神經系統損傷和疾病方面具有潛在作用，為遺傳性神經變性疾病的治療帶來希望。

人臍帶華爾通膠含有豐富的MSC。MSC在體外能夠大量擴增，還可凍存、復蘇，短期內即可獲得足量細胞用于臨床治療。UC-MSC不表達與移植排斥相關的HLA-DR，在混合淋巴細胞檢測中呈免疫抑制，并抑制T細胞增殖，異體移植該細胞可產生免疫耐受性[5]，表明其為一類免疫缺陷細胞，異基因移植不會發生免疫排斥反應。

動物實驗已證明，MSC具有促進神經修復的作用。將人UC-MSC移植至帕金森模型大鼠和正常大鼠，無排斥反應，無腫瘤產生及其他不良反應。治療后的第6周，尤其第12周，帕金森模型大鼠臨床癥狀得到明顯改善。其作用機理可能與人UC-MSC分泌多種多巴胺神經元營養因子和成纖維細胞生長因子有關，抑或與人UC-MSC具有的免疫抑制作用有關，使得受損的神經元恢復功能[6]。移植人UC-MSC可明顯改善共濟失調小鼠運動功能，減輕小腦萎縮，植入的UC-MSC可在小腦中停留至少3個月而無明顯分化，其作用機制可能與其提高某些神經營養因子如胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及血管內皮細胞生長因子（VEGF）在小腦中的表達有關[7]。移植人UC-MSC可有效改善中風模型大鼠的神經功能。人UC-MSC有向大腦缺血區遷移的能力，在損傷區域向膠質細胞、神經細胞、血管內皮細胞分化，促進損傷部位神經及血管形成，進而改善缺血區的血流。人UC-MSC分泌的各種神經營養因子在神經損傷修復中起到重要作用[8-9]。在臨床試驗中，Lee等將自體骨髓MSC通過靜脈或動脈輸注治療11例多系統萎縮（MSA）患者，經過12個月的觀察研究，發現癥狀得到明顯改善，UMSARA評分有顯著差異。認為自體骨髓MSC治療是安全的，在一定時期內延遲了疾病的進展[10]。我中心采用UC-MSC鞘內注射治療22例脊髓損傷（SCI）患者，13例有效，9例無效。不完全性SCI患者有效率達81.25%，完全性SCI的6例患者均無效。有5例有效的患者接受了2或3個療程治療，療效均有進一步的提高。且有效患者療效持久[11]。我中心采用UC-MSC鞘內注射治療脊髓小腦性共濟失調（SCA）與多系統萎縮小腦型（MSA-C）24例患者中23例有效，其中3例接受第二療程治療后獲得了進一步療效，41.61%的患者隨訪半年以上疾病仍在穩定狀態，而58.33%的患者在治療后1～14個月（平均3個月）疾病進行性發展[13-14]。本報道中父子2人經過UC-MSC鞘內注射治療1個療程后四肢肌張力降低、行走站立穩定性增加、言語較前流利，經第二療程治療后病情有進一步改善，但隨訪觀察發現療效不能持久保持。

目前認為，MSC治療神經變性疾病的機制，可能與MSC介導的神經保護作用有關，通過分泌的多種神經營養因子 （NTF），如腦源性神經營養因子（BDNF）、膠質細胞源性神經營養因子（GDNF）、β 神經生長因子 （β-NGF）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）等，支持神經細胞生存，誘導內源性神經細胞再生，促進神經纖維在損傷部位再生；而神經炎性機制在神經變性疾病發病機制中起著重要的作用，通過細胞間的接觸、免疫抑制相關的多種細胞因子的分泌，抑制T淋巴細胞活性，調節炎性反應，從而達到治療作用[8-9，14-16]。

在安全性方面，我中心采用UC-MSC鞘內注射治療22例SCI患者，治療后1例出現頭痛，1例出現腰痛，均在1～3 d內消失，隨訪3個月～3年，無治療相關不良反應發生[10]。我中心采用UC-MSC鞘內注射治療24例SCA與MSA-C患者，治療后2例出現頭暈，2例出現腰痛，2例出現頭痛，均在1～3 d內消失[12]。本報道中的2例患者經4個療程治療后，均未見任何不良反應發生，表明UC-MSC鞘內注射治療是安全的。

對于神經變性疾病，由于病因無法根除，UCMSC療效僅能維持一定時間，隨著移植細胞的凋亡，療效將會終止，疾病仍會進展。父子2人各通過2個療程治療后，神經功能得到改善，但分別在15個月及16個月后出現疾病進行性進展。因此，間斷給予UC-MSC治療可能是維持療效的一種方法。本報道病例數量少，治療安全性、療效、治療機制等需要大量病例的長期研究。

參考文獻

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